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蛋白纯化小白如何快速进阶成大神 | 研习社有招
发布:Cytiva(思拓凡)浏览次数:1910Superdex 200 Increase 10/300
又超压报警了?
两个分子量相当的蛋白想分离
又苦于无计可施?
…
这些场景你是否似曾相识?
没关系
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Q:Superdex200 Increase 10/300堵了、超压如何处理?
A:建议参考说明书CIP操作进行清洁 (NaOH溶液一般是最有效的清洁剂);同时也建议更换层析柱顶端滤膜或超声清洗;必要时移除层析柱顶端2-3 mm凝胶,调节adaptor消除顶端死体积。
Q:如何去除样品中的DNA/RNA等核酸杂质污染?
A:a.延长超声时间以降低粘度。也可以使用核酸酶如Benzonase同时消化DNA和RNA。如果来源是大肠杆菌裂解液,含有大量的DNA,可以用链霉素沉淀等方法,预先去除大量的 DNA。
b.通过层析方法去除:由于核酸带负电,在阴离子柱上会结合或阳离子柱上流穿,也可有效去除核酸。
Q:洗脱得到的His标签蛋白样品的杂带较多纯度不高,应如何改进?
A:a.杂蛋白对于金属离子也有较强的结合:优化结合、洗脱条件;尝试不同金属离子螯合的填料 (例如Co2+:HiTrapTALON crude预装柱和TALON Superflow填料);增加后续的纯化步骤,例如离子交换、凝胶过滤等等;构建双标签蛋白进一步纯化。
b.杂质与目的蛋白存在相互作用而共洗脱:在细胞破碎前加入去垢剂或还原剂,提高Wash buffer中去垢剂浓度(2% TritonX -100或2% Tween -20)或添加甘油 (20%以内)以破坏非特异性相互作用,HiTrap excel预装柱和Ni Sepharose excel填料将大大简化操作步骤。
Q:抗体平台正在工艺开发阶段,想要快速GX的Protein A填料?
A:a.2018年上市MabSelect PrismA,耐受0.5-1 M NaOH,并且配基长度、密度以及基架孔径和孔隙率等均经过优化,具有高耐碱和高载量的特点。
b.2020年,Cytiva推出新品HiTrap/
HiScreen Fibro PrismA,采用衍生的静电纺丝纤维素为基质,传质受对流流速控制,保留时间以秒而非分钟计算,在数分钟内即可完成一次实验循环。
Q:我的靶蛋白与杂质蛋白仅相差几个氨基酸,该如何分离?
A:分子量仅相差几个氨基酸的蛋白分子是比较难分离的,我们建议优先尝试高分辨率离子交换预装柱:Capto HiRes Q或Capto HiRes S系列,同时减少上样量并且拉大洗脱梯度进行优化。
Q:使用注射器手动操作HiTrap柱子进行样品纯化,如何控制流速?
A:1 ml/min = 在HiTrap 1 ml柱子上近似30滴/min;
5 ml/min = 在HiTrap 5 ml柱子上近似120滴/min。
2021-08-17 -
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