先导抗体分子产生之路——杂交瘤技术

近年来，在FDA每年批准的新药中，抗体药物占据了约1/5。这些抗体药物对应的适应症中，肿瘤治 疗仍是主流，其次是皮肤病和血液疾病。商业化抗体产品表现出靶点相对集中，居第 一的是PD-1/L1，紧随其后的是CD20、TNF、HER2等热门靶点。

抗体药的研发，从最 初的确定靶点，到筛选先导分子，做临床前研究，再到进入临床1/2/3期试验，以及完成最 后的NDA申报，整个流程基本需要耗费10年时间。纵观整个抗体新药研发流程，先导抗体分子就是故事的开始。可以说，能够开发出针对特定靶点的先导分子的企业基本就拿到了新药研发的入场券。

当前比较常见的先导抗体产生的技术路线主要有：杂交瘤、抗体库和单个B细胞。其中杂交瘤技术和抗体库技术应用较早，单个B细胞技术起步略晚，相对新兴。

杂交瘤技术又称为单克隆抗体技术：它的主要流程为先进行动物免疫，将特定的抗原注射到哺乳动物体内，使之脾 脏内产生大量分泌针对该抗原的特异性抗体的B淋巴细胞。由于B淋巴细胞是一种终末未分化细胞，存活一段时间便会死亡，所以需要将B淋巴细胞与不分泌抗体却能在体外无限增殖存活的骨 髓瘤细胞进行融合，产生具有两种细胞特性既能分泌抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞。两种细胞融合后，会产生五种类型的细胞，分别是未融合的B淋巴细胞、未融合的骨 髓瘤细胞、B淋巴细胞-B淋巴细融合体、骨 髓瘤细胞-骨 髓瘤细胞融合体以及所需要的杂交瘤细胞。接下来便需要进行杂交瘤细胞的筛选，去除不需要的四种类型细胞。

杂交瘤技术原理示意图

杂交瘤细胞的筛选一般包含两步，首先用HAT培养基进行筛选， HAT培养基中含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质。氨基喋呤可以对DNA的生物合成途径进行阻断，骨 髓瘤细胞会因为生物合成途径被阻断且自身缺乏应急合成途径导致不能增殖进而快速的死亡；而B淋巴细胞因缺乏体外增殖的能力，一般在10天左右死亡；杂交瘤细胞具有体外增殖能力且由于次黄嘌呤与胸腺嘧啶核苷酸的存在，可以通过应急途径合成DNA并在HAT培养基中正常生长，不会死亡。因此将融合后的细胞放于HAT培养基中培养，其他的融合结果会全部死亡，最 终筛选出杂交瘤细胞。

其次进行单个杂交瘤细胞的筛选，将培养基稀释到多孔板中，使得每孔仅含有一个杂交瘤细胞，再由这些单细胞克隆生产，最 终分泌出预定特异性抗体的杂交细胞株进行扩大培养。

在进行单个杂交瘤细胞筛选时，通常采用有限稀释法或者半固体培养基法。对于有限稀释法来说，为符合FDA的申报要求，需进行两轮有限稀释（LDC），或者一轮LDC结合图像证明以验证单克隆性。有限稀释法工作量大，往往需要运用自动化工作站进行高通量筛选。

有限稀释法进行杂交瘤筛选的典型步骤

贝克曼库尔特的实验室自动化工作站，可以整合细胞计数、离心机、细胞成像等各类设备完成自动化、高通量的有限稀释功能，并且可以配置HEPA过滤外罩和无菌移液枪头，保持细胞生长的清洁环境。

贝克曼库尔特实验室自动化

工作站Biomeck i7进行有限稀释

采用自动化工作站进行有限稀释，还会得到良好的一致性，经过五次有限稀释，每次稀释四块96孔板后的重复实验数据显示，平均每块板的单克隆率一致性良好，且没有位置偏好。

五次实验中每次实验的

四块板上的平均单克隆率

二十次重复实验每孔的单克隆次数

半固体培养基法是细胞生长在半固体培养基中，形成单克隆细胞团，同时将目的蛋白分泌在细胞团周围。半固体培养基中含有荧光标记的二抗，能与目的蛋白特异性结合，当用一定波长的光进行激发时能发出荧光。如此，便可使用图像分析软件对单克隆细胞团的大小和荧光强度进行测定，从而筛选出生长旺盛、表达量高的单克隆细胞团。

半固体培养基法进行杂交瘤筛选的典型步骤

丹纳赫生命科学旗下美谷分子仪器拥有ClonePix 2哺乳动物细胞克隆筛选系统，可用于杂交瘤细胞的筛选。ClonePix 2将单细胞识别和产率筛选整合在一起，而且提供克隆图像证据，将筛选时间从两轮减少到一轮，大大简化单克隆筛选流程。

美谷分子仪器的ClonePix 2 系统

自动确定和挑取单细胞来源的克隆

虽然杂交瘤生产出的单克隆抗体后续需要进行人源化处理，但是利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产，目前已发展成为一种成熟的生产单克隆抗体的方法，广泛用于多种抗体的开发。