抗体偶联药物ADC - “生物导 弹”的首次连续流合成

研究背景

抗体偶联药物（ADC，Antibody-drug conjugates），被称为肿瘤的“生物导 弹”，是将类似于化疗的细胞毒性药物与单克隆抗体连接在一起，从而实现对肿瘤组织的靶向杀伤功能。其结合了靶向疗法和化疗疗法的作用原理，具有靶向性高，特异性强，毒副作用小等优点。

早在2015年，Jones团队利用流动化学实现通过小分子标签加工蛋白质(包括抗体)的可行性，并成功地利用直接的一步生物偶联天然赖氨酸侧链，对蛋白质和抗体进行修饰。（ 请参考：J. Flow Chem. 2015, 5, 151-154)

但在ADC中，由于抗体中有超过80个暴露的且具备反应活性的赖氨酸残基。如此多的活性位点会使得偶联反应产生多种偶联混合物。ADC的连续化合成目前未见有报道。

结合之前Jones的工作，研究者决定尝试以连续流反应器合成ADC。

ADC合成概述

通过半胱氨酸等内源性氨基酸，在二硫键间的连接位点合成ADC是一种常见的方法。这种偶联方法需要对蛋白质分子进行氧化还原，以释放活性硫醇部分。

该生物偶联过程可分为两个步骤: 通过三（2-羧乙基）膦（TCEP）还原抗体，然后巯基与马来酰亚胺药物偶联（如图1）。

图1. 半胱氨酸基ADC的合成方案

这种偶联技术具有优势，因为其控制的药物-抗体比（DAR）（典型DAR值在3.5 - 8之间）和相对较低的异质性，目前主要使用传统的间歇反应器进行合成。

作者使用连续流反应器和传统的含马来酰亚胺药物连接剂生产ADC，开发出一种连续制备9个半胱氨酸偶联ADC的工艺（图2），在几分钟内从天然抗体实现ADC合成，且所得ADC的目标DAR和聚集特性与市售ADC相似。

DAR简介

DAR（Drug-to-Antibody Ratio，药物抗体比值）是抗体药物偶联物的一个关键属性，是ADC药物研发过程重要的质控环节。ADC药物从本质上讲是混合物，是由连接不同个数小分子药物的单抗组成。

DAR代表的是每个单抗上连接小分子药物的平均数量。DAR直接影响ADC药物的疗 效和安全性，药物研发阶段应尽量缩小DAR值的变动区间。

研究过程

一. 连续流工艺

作者基于之前使用连续流反应器的经验，此次使用的是V型混合器+管式反应器。实验设计时，除了考量反应时间和温度，管式反应器的长度也是此次工艺优化的关键变量。

图2. 连续流合成流程图

管式反应器的长度直接影响反应时间（反应器1用于TCEP还原，反应器2用于药物偶联。  因此，作者评估了反应器长度和产生的ADC的 DAR之间的关系（表1）。

在初步可行性研究中，作者选择曲妥珠单抗（Trastuzumab）和药物连接剂MMAE进行偶联。通过反相高效液相色谱(RP)分析，将间歇反应器和连续流法生产的ADC进行了直接比较。

表1. 间歇式反应器和连续化反应结果比对

二. 工艺条件研究

• 在间歇法的生物偶联中，通常需要超过1小时的时间来完成ADC偶联步骤。

• 而使用管式反应器，在37℃下进行3min TCEP还原，然后在25℃下偶联药物 3min，得到的ADC的测量DAR值为3.2（表1，条目1）。

• 当偶联反应时间降低到1.5 min时，得到的ADC的DA值R没有变化（表1，条目2）。

• 偶联时间进一步降低到0.75 min也没有显著降低，但将Reactor-2停留时间降低到0.38 min，得到的ADC的DAR值小于2。

• 还原步骤（Reactor-1）的时间从3min减少到1.5min也导致ADC的DAR值小于2。

三. 反应底物的拓展

作者进一步评估了其他抗体和药物连接子，以验证连续流化学方法合成ADC的普遍性和可靠性。

如表2所示：通过连续流反应器，作者制备9个半胱氨酸偶联ADC，都取得了不错的结果。

表2. 底物拓展研究实验

总结

• 首次使用连续流技术实现ADC合成；

• 通过优化反应时间，温度等因素，开发了9种ADC的连续流合成工艺；

• 连续流动化学可用于开发一种可靠而稳健的ADC生产工艺；

• 连续流工艺可与间歇式生产的ADC相媲美，并显著缩短反应时间；

• 连续流工艺易于放大的特点，更容易实现放大生产。