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助力基因ZL-SCIEX毛细管电泳多重表征整体应用方案

发布:SCIEX
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基因ZL可以在DNA和mRNA水平上对致病基因进行修正从而达到治LX果,相对于传统药物,对于一些成药性较差的靶点具有独特优势,因此基因ZL对于特定基因引起的疾病有极大的应用潜能,其中肿瘤和罕见病是基因ZL最主要的应用领域。在ZG,基因ZL药物Gendicine于2004年获得国家食品药品监督管理局的批准上市,成为世界上shou个获批上市的商业基因ZL产品。2005年,溶瘤病毒产品Oncorine也在ZG获批上市,目前,已有300余个基因ZL产品已经上市或正在FDA和EMA的监管下进行开发,这些基因ZL产品都涉及持续的编码蛋白质DNA转移,并利用了多种体内和体外技术。


使用毛细管电泳SCIEX PA 800 Plus药物分析系统,可广泛应用于基因ZL中的质粒DNA纯度分析、腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的纯度分析、腺相关病毒的等电点分析、宿主细胞残留DNA的片段分布分析等许多方向,并具备以下优势特点:

· 分离度好:可基线分离超螺旋、开环及线性的质粒,可基线分离AAV的VP1、VP2、VP3蛋白,易于产品的定量及质控;

· 重复性好:超螺旋质粒:迁移时间相对标准偏差(RSD)<0.5%,校准峰面积RSD<2%;AAV衣壳蛋白:迁移时间RSD<0.5%,校准峰面积RSD<5%;AAV等电点:pI的RSD<0.2%, 峰面积RSD<2%。

· 灵敏度高:使用激光诱导荧光的检测模式等,可提供超高的检测灵敏度;

· 操作简单:具有商品化的试剂盒,自动化程度高;

· 适用范围广、方法灵活度高:适用于不同大小范围的质粒的分析;针对不同血清型AAV,可优化方法得到更优异的纯度和等电点分析结果;

· 符合法规:仪器具有操作(OQ)认证,操作软件能够进行权限设置和审计

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图1. SCIEX PA 800 Plus药物分析系统与试剂盒


01-毛细管凝胶电泳法(CGE-LIF)对质粒DNA的纯度分析


质粒DNA作为基因制剂的传递载体,被广泛应用于基因ZL、细胞ZL、疫苗等生物制品领域。质粒DNA主要有三种拓扑结构,超螺旋、开环和线性形式。超螺旋质粒在细胞转染及基因表达方面优于其他形式,所以,高质量、高纯度的超螺旋质粒DNA是确保基因制剂安全性和有效性的前提条件。欧洲药物评审组织(EMEA)在关于“慢病毒载体的生产与开发”指导方针中指出,有必要在慢病毒载体的生产中使用高质量的质粒DNA。美国食品药品监督管理局(FDA)用于基因制剂质粒DNA指导意见的要求,超螺旋质粒百分比需大于80%。我国《生物技术药物研究开发和质量控制》一书中指出,对于质粒类生物制品超螺旋比例一般要大于90%。在质粒的研发和生产过程中,质粒的纯化工艺研究,制剂配方工艺研究,大规模生产的批次一致性,都需要对质粒的超螺旋结构进行质控检测。使用SCIEX PA 800 Plus药物分析系统,结合激光诱导荧光检测器(LIF)和dsDNA 1000 试剂盒(货号477410),可以对质粒的三种拓扑结构进行GX分离,并能准确计算超螺旋百分比,用于质粒的纯度检测(图2)。


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图2  CGE-LIF方法分析质粒的纯度


02-CE-SDS-LIF方法测定腺相关病毒衣壳蛋白的纯度


腺相关病毒(AAV)是常用于细胞/基因ZL的载体,由衣壳蛋白及包装的核酸组成。AAV具有表达时间长、特异性强、安全性高、免疫原性低等优势,是细胞/基因ZL中重要的组成部分。AAV衣壳主要分为VP1、VP2和VP3三种蛋白构成,三种衣壳蛋白的纯度分析是AAV产品质量和安全的重要检测项目;而AAV产品具有多种血清型,且普遍浓度较低,需开发一种针对不同血清型均具有较高分离度和灵敏度的分析方法。SCIEX PA 800 Plus药物分析系统连接激光诱导荧光检测器(LIF)(图1)并使用SDS-MW分子量测定试剂盒是分析AAV衣壳蛋白纯度的有效方法,检测结果如图3。

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图3. CE-SDS-LIF方法分析AAV衣壳蛋白的纯度


03-毛细管凝胶电泳法(CGE-LIF)分析宿主细胞残留DNA的片段分布


生物制品中的疫苗、重组蛋白药、抗体药等产品多采用连续传代的动物细胞株表达生产。虽然经过严格的纯化工艺,但产品中仍有可能残余宿主细胞的DNA片段。这些宿主细胞残留DNA(HCD)可能带来传染性或致瘤性风险。现有研究表明,一个功能基因至少在200 bp以上,因此残留DNA片段越大,风险等级越高。美国食品药品监督管理局(FDA)关于人类基因ZL新产品生产指导文件中明确指出HCD的片段要小于200 bp;国家药品监督总局(NMPA)生物制品药学部同样在基因ZL产品药学研究与评价技术指导原则的征求意见稿中指出,HCD的片段要小于200 bp。因此基因ZL终产品中需要合适的方法检测HCD的片段大小分布情况。使用SCIEX PA 800 Plus药物分析系统,结合激光诱导荧光检测器(LIF)和dsDNA 1000 试剂盒(货号477410),可对HCD进行片段分布检测(图4)。


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图4 CGE-LIF方法分析DNA片段标准品的大小


04-cIEF方法测定腺相关病毒的等电点


腺相关病毒(AAV)是由结构蛋白与内部核酸物质组成复制缺陷性病毒,由于其具有表达时间长、特异性强、安全性高、免疫原性低等优势,被广泛认为是介导基因ZL的理想载体之一。病毒颗粒的衣壳表面暴露的氨基酸侧链决定了AAV具有特定的等电点(Isoelectric Point,pI),内部核酸的填充情况会造成AAV等电点的差异。AAV是通过重组表达生产,不同的血清型及病毒构建的不完整性均可影响产品的等电点,因此等电点的特性可用于鉴别和监控AAV的种类和产品质量。SCIEX PA 800 Plus药物分析系统与cIEF等电点测定试剂盒可以直接分析完整病毒颗粒,不存在污染毛细管或堵塞毛细管的情况,是测定AAV等电点的有效方法,检测结果如图5。


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图5. cIEF方法分析AAV的等电点


综上所述,SCIEX PA 800 Plus药物分析系统可广泛应用于基因ZL中的质粒DNA纯度分析、腺相关病毒衣壳蛋白的纯度分析、腺相关病毒的等电点分析、宿主细胞残留DNA的片段分布分析等许多方向,在同一平台上实现多重表征与应用,全面支持监管合规,为您的生物制品成功保驾护航。



2021-04-27
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