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梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司
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【干货】如何加速生物药研发突围?

发布:梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司
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据Insight 数据库显示,过去十年国内抗体类临床项目涉及将近150个靶点。其中TOP20的靶点占总临床项目数的62%,可见靶点选择的重复和扎堆。以PD-1为例,目前国内在研的PD-1产品的企业有100多家,进入临床阶段的PD-1则超过50款,国产获批上市的5款,还有4款处在上市申请中。PD-1赛道早已成为一片红海。另一个理想的肿瘤药靶点Claudin 18.2亦有此趋势 , 目前进入临床阶段的Claudin 18.2 靶点药物已接近20款,公开布局的企业超过30家。


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图1:赛道竞争激烈/ 图片来源Unsplash


7月2日,CDE发布了《以临床价值为导向的抗肿瘤药物临床研发指导原则》。通告指出:试验设计选择阳性对照药时,应关注阳性对照药是否反映和代表了目标适应症患者的ZJ用药情况。这也意味着,后续同靶点同适应症的药物研发直面的竞争越来越激烈。延伸到早期工艺开发,包括对细胞株、培养工艺和下游纯化以及制剂工艺的开发和优化要求亦会越来越高。


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图2:CDE官网通告


在细胞培养工艺中,pH和溶氧是关键过程参数,进行实时监测与调控已成共识。CO2或因为早期工艺开发使用的反应器体积小,不易聚积而被忽视,或因鲜有相关在线监测和调控的研究与实践参考,一般作为调节pH的通气策略,没有作为实时在线监测的参数进行调控。然而CO2积聚对工艺放大和后期大规模生产的影响越来越受重视, 尤其是当下工艺优化后总细胞量和活细胞量不断提高,商业化生产反应器体积不断增大的情况下。在线测量CO2的必要性也被广泛的讨论。


以CHO细胞为例:在由糖酵解和三羧酸循环组成的需氧ZX碳代谢网络中, CO2 在多种可逆和不可逆的反应中都会产生和被消耗。通常可以简单理解为细胞呼吸,消耗一份O2,产生一份CO2 。而CO2作为不带电的极性分子,能够自由的透过细胞膜,改变细胞内的pH值, 且这一过程绕开了细胞膜正常用来控制H+浓度的机制(离子转运通道)。 过低或过高的CO2水平引起的细胞内pH值变化导致细胞的生长和生产受到影响。


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图3:溶解的CO2能够自由通过细胞膜,影响胞内pH值


Brunner 的团队通过新型分离控制策略在CHO 细胞中研究了单因素pH( 6.8, 7.0 和7.2 ) , pCO2 ( 5%, 12.5% 和20%) ,pO2及其交互作用对细胞生长及蛋白质量的影响。试验表明,pCO2 既不能太高,也不能太低,在12.5% (94mmHg)时活细胞数ZG (图4)


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图4:pH, pCO2和pO2对活细胞(VCD)的影响


Brunner的研究中,CHO表达的蛋白半乳糖化(G1)和盐藻糖化(aF1)在pH为7.2时,水平ZG(图5A)且与唾液酸化(S1)和甘露糖(Man 8)具有相关性(图5C),但 G1 随着pH和pCO2的变化则较为复杂,当pH为7.2,pCO2控制在12.5%,蛋白的半乳糖化G1 水平ZG,不能太高(pCO2为20%时,G1水平只有21%)也不适宜太低 (图5B)。再一次印证了pCO2关联影响pH 进而影响细胞生长和蛋白翻译后修饰。


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图5 : pH, pCO2和pO2对蛋白半乳糖化(G1), 唾液酸化(S1)和盐藻糖化(aF1)的影响


在工艺开发阶段,台式生物反应器体积小,CO2积聚少,对工艺的影响确实会被忽视。随着活细胞总量不断提高,细胞呼吸产生的CO2增多。同时反应器体积增大,CO2在反应体系中的滞留时间增加,导致培养体系中积聚的CO2更多。从而需要工艺开发人员 在早期就把CO2这一关键过程参数纳入DoE试验中,探索合理的设计空间,才不会在后续工艺放大和生产中遇到技术转移的问题。


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图6:测量溶解CO2的原因


相比于pH和溶解氧可以借助在线传感器很方便地进行实时监测, CO2的测量主要是采用血气分析仪进行离线取样测量,测量CO2分压,即pCO2。然而离线取样测量一来受取样操作的限制,需要在规定的流程和时间要求下完成测量,无法准确反应培养体系中溶解的CO2,即dCO2情况;另一方面,作为动态变化的参数,取样无法实时测量,从而无法充分获得工艺中dCO2的动态变化进而无法及时进行调控。

  

梅特勒-托利多创新地突破技术限制,发明了可应用于反应器中在线监测dCO2的传感器。探头式的设计可直接安装在早期工艺开发用的小型台式生物反应器,也可以通过传感器护套, 安装在后续放大生产用的大型生物反应器,实现无缝放大。在线dCO2传感器很大程度上解决了无法准确、实时测量并参与调控的困扰。现阶段,梅特勒-托利多的在线dCO2传感器已经有一定的应用基础和良好的用户反馈。


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图7:在线dCO2传感器(右)经验证可表征工艺中CO2的变化


回顾CDE发布的一系列指导原则,从长远来看,无论是创新药或类似药,患者对LX更好,ZL费用更易承担的药物的需求必然会驱动药企从早期工艺开发、放大和技术转移等环节,更加重视关键过程参数的监测,尤其是那些还在离线测量的参数。


* 部分图片来源于网络,侵删


2021-08-21
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