细胞手动计数怎么做？看完这篇全能懂！

什么是细胞计数？

       计数是细胞培养过程中不可或缺的重要步骤之一。 运用专业有效的计数方法，可以准确的测定细胞数量，检测细胞的活力状况（活细胞的比例），这对细胞培养过程中的环境条件的控制、细胞生长状态的监控，至关重要。

准备工作

1、血细胞计数板预处理

       用酒精清洗并擦拭盖玻片，并让酒精自然挥发干。

2、细胞悬液的准备

       悬浮细胞可直接通过取样，离心，重悬后，直接获取细胞悬浮液。贴壁细胞可使用胰蛋白酶进行消化后离心、重悬。

       轻轻用移液枪吹打细胞悬液3-5次至细胞均匀分布在液体中。

       立刻吸取10-20 µL的细胞悬液样品至新的微量离心管中，并按照1:1的比例加入等量的0.4%的台盼蓝染液，混匀后，静置1-2分钟。

细胞计数板的构造

加样计数

       轻轻吹打染色后的细胞样品，吸取10-12 µL加至血细胞计数板凹槽处，利用毛细现象使样品均匀铺开。

       在显微镜下对准计数板样品区域，用10倍物镜聚焦至计数板的网格线上。

       视野中，活细胞会拒染台盼蓝，呈现透亮的光泽，边缘轮廓清晰，死细胞则被台盼蓝染色，呈现出不透明的蓝色。对计数板四角的四个大格中的细胞进行计数（需要测定细胞活力时，活细胞、死细胞需分开单独计数）。对于压住四周边缘线的细胞，仅将其中2条线作为压线细胞可计入计数的范围（如仅计算左边和顶部两条线的压线细胞）。

       移动计数板，至视野内出现移至下一组16个角格的大格进行计数，直到所有4组16个角格全部计数完毕。

样品中细胞浓度的计算

计算过程

       假设四个角方格计数分别为A、B、C、D。

       四组16个角方格计数出的细胞总数为 (A+B+C+D)。

       取每组16个角方格的平均细胞数即 (A+B+C+D)/4。

       则计数样品中的细胞浓度为 (A+B+C+D)/4 x10⁴个/mL。

       （血细胞计数板每个大方块可以容纳的体积为：1mm²×0.1mm=0.1mm³=10^-4cm³=10^-4ml，即每个大方块的体积为万分之一毫升，因此在计算每毫升液体中的细胞数时需要乘以10⁴）

       则加入台盼蓝之前的细胞原液的浓度为上述浓度的2倍 (A+B+C+D)/2 x 10⁴个/mL。

       假设上述计数过程中四个角方格中的活细胞数目为E，死细胞数目为F。

       细胞活力（活细胞比例）=E/(E+F) x

应用举例

       如果16个方格的细胞计数分别为51、42、47、55，则计数样品中的细胞浓度为

(51+42+47+55)÷4x10⁴x2=9.75x10⁵个/mL 

温馨小Tips

       1. 血细胞计数板为玻璃材质，在使用前后需小心处理、轻拿轻放，避免摔碎。

       2. 台盼蓝染料内往往会存在一些不溶的杂质，干扰计数结果。因而，在染色前对台盼蓝染料进行离心，吸取上清使用有利于减少杂质引起的计数误差。

       3. 台盼蓝染料有一定的细胞毒性和致癌性，确保染色后的细胞在10分钟以内完成计数，并且避免皮肤直接接触。

       4. 加样至计数板凹槽时，确保细胞悬液均一地在盖玻片和计数板之间铺平，如有细胞在计数区域产生，会影响计数结果的准确性。

       5. 计数图像的清晰度对计数结果的准确度有较大的影响。计数前请务必确保调整相机的焦距至激光蚀刻线清晰可见，此时活细胞中部有明显的光泽、轮廓清晰。

       6. 四个大格内的细胞总数控制在100-200个之间时，计数的准确度更好，细胞浓度过低或者过高都会影响计数结果。聚团细胞按一个细胞计算，但若视野中出现的聚团细胞较多，需考虑样品制备时消化过程是否处理不当。

       7. 为了减少单次计数的误差，可对一个样品进行多次计数取平均值。