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Jess Superplexing技术:3μL样本实现多重定量Western Blot

发布:ProteinSimple, a biotechne brand
浏览次数:463

       传统的WesternBlot,耗时长,手工操作多,重现性差(CV>35%)。遇到珍惜样本,蛋白量不足时:无法进行蛋白质多靶点分析,不能实现分子机制的深入研究。


Jess全自动定量Western Blot的特点:

  • 只需3μl样本(分选干细胞、免疫微环境细胞、珍稀临床样本等)

  • 四通道:化学发光、双色红外荧光、总蛋白检测通道

  • 全程4小时:实现靶蛋白、靶蛋白磷酸化、样本总蛋白检测

  • 定量数据


       ProteinSimpleZxin发布的 Jess Superplexing Application Note中,利用Jess的不同的检测通道(化学发光,双色红外,样品总蛋白),以总蛋白作为loading control进行靶点蛋白的相对定量,评估p-Akt和总Akt水平。在3μL样本,实现p-Akt, Akt和相对于总蛋白的相对定量。

       总蛋白作为LoadingControl将会取代传统的内参蛋白。

Jess全自动多通道定量Western Blot Superplexing检测原理

       Jess检测顺序:首先检测样品中总蛋白质信号,接着进行双色红外荧光western blot,Z后进行化学发光Western Blot。单次实验结束,获取:总蛋白结果,双色红外荧光western blot结果,化学发光western blot结果。

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Jess Supleplexing实验举例

       实验设计:

       样品分为两组:Jurkat或Jurkat + Calyculin A(Calyculin,PP1/PP2A的YZ剂。可以诱导Akt产生磷酸化)。

       样品量:各3μL

       多通道检测:

       Ø  化学发光检测:p-Akt

       Ø  NIR检测:总Akt

       Ø  总蛋白检测通道(完全独立于其它两种检测通道):总蛋白(作为loading Control)

       结果:

1.    多种数据模式同时提供(传统western blot 条带图,积分峰形图,原始定量数据)

1.jpg

1.jpg

2.   Jess总蛋白归一化功能,将总蛋白作为内参,体现可比数据的真实性

       不种浓度(0.4, 0.6, 0.8mg/ml)的Jurkat+Calyculin A的全细胞裂解物的原始数据(橙色条),和做过蛋白归一化校正后的(蓝色条)相对定量值。

       两个靶点p-Akt(图A)和总Akt(图B)。

       随着Jurkat + Calyculin A裂解物的浓度增加,p-Akt表达的原始数据增加(图A,橙色条)。但是,归一化后的结果说明,所有三个不同浓度Jurkat + Calyculin A样品中检测到了类似水平的p-Akt(图A,蓝色条形),即p-Akt水平并不会随着上样裂解物浓度的增加而增加。

       样本中蛋白质磷酸化的水平不会随上样浓度改变而改变。

       这些数据说明,如果没有总蛋白作为内参进行校正,会得到不真实的数据结果。

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小结:

       Jess Superplexing技术在同时使用化学发光和双色红外荧光通道,仍然可以通过独立通道检测各个样品的总蛋白。它的多通道使用功能可以对少量样品(3μL),获得尽可能多的数据,且只需Z少的动手时间即可完成实验设置和数据分析。

       欢迎使用全自动多通道定量Western Blot技术:Jess Superplexing!

参考文献:

1.Akt regulates cell survival and apoptosis at a postmitochondrial level, H Zhou, XM Li, J Meinkoth and RN Pittman, Journal of Cell Biology, 2000; 151(3):483-94.

2. The protein kinase PKB/Akt regulates cell survival and apoptosis by inhibiting Bax conformational change, H Yamaguchi and HG Wang, Oncogene, 2001; 20:7779-86.



(来源:ProteinSimple)

2020-02-17
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