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公司新闻
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Agilent-BioTek:助力干细胞产品开发的便利工具
发布:安捷伦科技(中国)有限公司浏览次数:1592006 年,日本科学家山中伸弥团队在将四个转录因子(Oct4, Sox2, Klf4 和 c-Myc)组合转入小鼠胚胎或皮肤纤维母细胞中,使其重编程而产生了诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell——iPSC),该细胞具有类似胚胎干细胞多能分化潜能。由于其易于获取、易于放大培养,具备多能性且免疫原性低,在干细胞治 疗中颇具优势,诞生之初立刻成为了干细胞研究的热点。
关于 iPSCs 的研究和应用日新月异,目前主要的商业化研究方向和应用领域集中在:细胞治 疗、药物发现、毒理学测试、疾病建模和个性化医学定制这五个方面。无论是直接把 iPSC 用作药物进行治 疗,还是将其作为工具进一步开发利用,开发者都需要对其进行表型筛查和功能学鉴定,以满足相关的法规要求。Agilent-BioTek 可以为 iPSC 相关的培养、鉴定工作提供便捷、高效的工具。
Cytation5 多功能细胞检测系统(左)
和 Multiflo FX 液体处理系统(右)
转染效率的评估
传统的 iPSC 是采用转染的方式获取的,市场上有部分商业化可用的种子库,需在一定代次内使用;若企业自行开发 iPSC 种子库,则评估产量、提高产量——即评估转染效率,是整个产品开发过程中排在首位的关键点。
转染效率通常使用报告基因体系或成像分析检测体系进行评估,而这两种体系在BioTek Cytation 系列多功能成像检测系统上均可进行使用 ,两者相互验证,相辅相成。例如内布拉斯加大学林肯分校的研究团队为了评估转染效率最佳的组合,就使用了两种方法相互映证[1];除了常规的转染法,无异源化学诱导最近也取得了一定的突破,北大生科院邓宏魁教授研究组即使用报告基因的方法来检测 OCT4 的表达情况[2]。
从培养到分化,iPSC 表型检测
包括增殖率检测、倍增时间检测、细胞活性的检测;也包括对 iPSC 多能性维持和分化情况的分析判断,形态学分析、标志物染色分析等方面。明尼苏达大学干细胞研究所将 Cytation 整合进了自动化工作站中[3],使用 Cytation 对 iPSC 的自动化培养、维持、分化过程进行监测,实现了可复制、可扩展的iPSC培养和分化。在这个案例中,Cytation 成像系统主要进行 3 项工作:
无标记融合度检测——为不同细胞系的自动化换液、传代流程的建立和更改提供数据支持;
iPSC 多能性维持的检测——为构建的 iPSC 细胞系的稳定性提供依据;
分化的检测——对分化后的特异性表达蛋白表达进行检测,评估分化结果。
Cytation 提供的无标记融合度分析
很好的完成对细胞生长情况的监控
通过Cytation 对荧光图像进行荧光强度、阳性细胞数量、面积等分析,完成对 iPSC 分化情况的监控
Cytation 搭载的 Gen5 软件本身也是一款高内涵授权的分析软件,可以针对画面进行计数、信号强度、样本尺寸、面积、亚群等多参数进行分析,多角度制定研究和工艺监测流程
液体处理系统提高工业 iPSCs 的生产效率
对用于工业化生产的 iPSC ,使用机械化设备进行流程化、可扩大、可复制的样本制备,既可减少人力提高生产效率,又可保证产品均一性,是非常明智的选择。Agilent – BioTek 拥有强大的液体处理系统,可自动进行高度均一化的细胞铺板、换液洗涤、免疫染色等机械繁复的操作,贴壁细胞、悬浮细胞球、磁珠筛选等体系均可使用。
iPSC 在药物筛选和开发的应用潜能
心脏中过量的铁积累可导致铁超载心肌病(IOC),斯坦福心血管研究所利用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs),模拟 IOC 并筛选药物来拯救铁超载表型[4]。可以观察到 iPSC 诱导形成的心肌细胞能够构建成 3D 类器官,并表现出了相应的生理特性,受到铁过载后表现出相应的收缩-舒张损伤。
IOC 引起的表观现象,氧化应激和线粒体损伤在 iPSC-CMs 中同样能被观察到。数据使用 Cytation 5 多功能检测系统获取
使用 iPSC-CMs 作为工具进行后续的研究,团队成功找到了 Fe2+ 摄取的关键受体 DMT1 ,并在找到候选药物 ebselen ,能够有效抑 制 iPSC-CMs 对 Fe2+ 的摄取,且显著降低了 ROS 的产生。
该平台发现了 ebselen 作为一种潜在的治 疗药物,也证明 iPSC 可以作为一种发现和筛选新药物的有效工具。
利用 iPSC 可构建多种用于药物毒性检测的细胞系,例如使用 iPSC 诱导形成的肝细胞(iCell Hepatocytes)用于药物的肝毒性评估[5]。作者构建了 2D 和 3D 两种肝细胞模型,均进行了 ROS 、线粒体膜电位和质膜破裂的检测,经已知会引起肝脏毒性的药物处理:对乙酰氨基酚(5000 ~ 0 μM)、丝裂霉素 C (10 ~ 0 μM)和甲苯卡酮(200 ~ 0 μM),两种模型均表现出了与药物浓度正相关的胞内 ROS 累积、线粒体膜电位降低、以及细胞死亡。
ROS:ROS-id Total ROS/Superoxide 试剂盒,该试剂盒检测总 ROS(氧化应激,绿色)和超氧化物(橙色)
线粒体膜电位(MMP):MITO-ID 是一种阳离子染料,根据膜电位状态发出绿色或橙色荧光。膜电位高:橙色;膜电位低:绿色
质膜破裂(PM rupture):NUCLEAR-ID含有两组成分,用于标记活细胞的蓝色细胞渗透性核酸染料,和用于死细胞核标记的红色非细胞渗透性核酸染料
药物孵育引起的表观现象,在 2D iCell Hepatocytes 中能观察到随药物浓度增加(自左向右增加)而加重的(A-C)氧化应激、(D-F)线粒体损伤和(G-I)细胞死亡。图像使用 Cytation 5 多功能检测系统获取
药物孵育引起的表观现象,在 3D iCell Hepatocytes 中能观察到与 2D iCell Hepatocytes 同样的表现。图像使用 Cytation 5 多功能检测系统获取
另外,研究人员发现,所构建的 2D 细胞于 7 天开始失去黏附,而 3D 细胞球能够经历 14 天的长时间加药培养,这从一定角度说明,3D 细胞模型相比 2D 细胞能检测更长的周期,这更有利于人们进行完整的药理学检测和表征。
以上一些案例,仅仅是广大干细胞工作者使用 Agilent-BioTek 进行产品开发的冰山一角,iPSC 易于获取、具有多能性使其拥有广阔的应用前景,在细胞治 疗、高通量药筛、药敏检测、个性化医疗定制等领域同样备受关注。
而 BioTek Cytation 系列产品也在各个领域均有相关应用,该系统集多功能微孔板检测和多功能活细胞全自动显微成像于一体。在细胞增殖,细胞运动,细胞稳定性检测,细胞免疫反应,疫苗研发,3D 细胞培养、类器官药敏检测、高通量筛选等方面均有优秀的表现。
该系统具有成像质量高、环境监控严格、自动化操作、高通量智能化分析等特点,可安全、灵活的完成各类基于细胞的检测分析,无论是基于酶标体系的高通量筛选还是基于细胞体系的成像筛选,无论是简单的细胞拍摄还是长达数周的细胞培养观测,Cytation 系列产品均能胜任。
[1] Comparison of promoter, DNA vector, and cationic carrier for efficient transfection of hMSCs from multiple donors and tissue sources. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 2021; 26.
[2] Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun. 202;12(1):3017.
[3] Automating Human Induced Pluripotent Stem Cell Culture and Differentiation of iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium for Personalized Drug Testing. SLAS Technol. 2021 Jun;26(3):287-299.
[4] Modeling Secondary Iron Overload Cardiomyopathy with Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Cell Rep. 2020 Jul 14;32(2):107886.
[5] Long-Term Hepatotoxicity Studies using Cultured Human iPSC-Derived Hepatocytes. Application Note. August 15, 2017
2022-09-15 -
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