培养基分析和细胞培养过程监控方案

“助力提高生物药表达量和质量-细胞培养基和代谢分析完整解决方案”之一

近十年来，生物医药产业蓬勃发展，国内外市场规模仍保持高速增长。除了治 疗性蛋白药物，疫苗产业也在不断升级和创新，新冠疫情是全 球疫苗产业发展的助推剂，引发了新一轮的爆发式增长。此外，基因和细胞治 疗全 球发展迅速，定将是生物医药领域未来十年一个重要的发展方向。

细胞培养是生物医药产业的核心环节之一，贯彻生物医药研发和生产的全生命周期。无论是蛋白药物的 CHO 细胞、疫苗的 Vero 细胞，还是细胞治 疗的 CAR-T 细胞，培养基和培养工艺条件都是细胞培养过程的关键要素。培养基是“一个包含无机盐、糖、氨基酸和维生素以及其他必须营养物质的等渗透压且具有 pH 缓冲能力的混合物”，给细胞生长提供微环境和营养物质。不同的细胞具有不同的特征，用于培养它们的培养基组成应与细胞的要求相匹配，不合适的培养基会影响细胞的生长状态和功能。

另外，培养基营养成分的消耗以及代谢废物毒物的积累，也与细胞功能和蛋白的表达密切相关。因此，定期监测糖、代谢物、维生素、氨基酸和代谢物等的变化，以优化补料策略以及收获时间，并同时选择合适的细胞培养基，这些对于提高细胞密度和活率，最 大限度地提高蛋白产量，确保蛋白质量是非常重要的。此外，除了监测培养环境中营养物质和代谢产物的变化，也需要对细胞本身做更深度的研究，细胞的“生老病死”、蛋白的表达都是细胞功能和代谢的结果。不管是培养基设计，还是培养工艺优化，都离不开这些研究。

因此，无论是生物制药公司，还是培养基生产商，只要涉及细胞培养，都需要开发培养基成分和细胞代谢物与功能的监测方法。传统的培养基分析，检测流程过于复杂，主要是对葡萄糖、氨基酸和维生素等进行分析，其他很多成分不进行检测；而且不同类型的成分用不同的样品处理和分析方法，分析时间长，成本高，这种检测流程已不能满足工业快速、标准化的要求。而液质联用技术因其具有高通量、专属性强和准确度高等特点，使其能够很好的解决普通检测流程出现的问题。另外，对于细胞本身的监测，目前大家主要关注的是生长密度、活率、倍增时间等细胞状态的变化，对于细胞功能本身的深层次的分析还比较少。通过 Seahorse 和高分辨质谱等技术, 综合细胞功能和分子代谢物水平对细胞代谢做全面研究。

安捷伦和测简奕共同开发的细胞培养基和代谢分析完整解决方案，包括培养基原料分析、培养基成分消耗监测和细胞代谢研究等，为细胞培养提供全面的质量控制和深度研究，为培养基和培养工艺开发和优化指明方向。

培养基成分消耗和代谢物监测

有机物分析

培养基营养成分消耗和代谢物的积累，是细胞培养工艺开发关注的重 点。方案中的 LC QQQ 技术平台可以定量监测 151 种化合物的消耗或者产生，包括氨基酸、维生素、核苷类、胺类、有机酸、糖类和脂类以及这些化合物的衍生物。方案方法包中有其中 80 种化合物的混合标准品，可以对这 80 种化合物的绝 对含量进行检测。有了精 准监测的数据，可以实现精 准补料，确认补料的化合物种类、浓度以及时间点；也可以针对产生的代谢毒废物情况，及时调整工艺参数或者加入中和物质，降低毒废物对于细胞本身以及蛋白产量质量的影响。

可监测的 151 种化合物列表如下：

可绝对定量的 80 种化合物的定量限、线性范围数据如下：

Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统

元素分析

随着细胞培养基配方变得越来越复杂，生物制药领域对于培养基中原物料的关注度也越来越高，其中对培养基中元素变化进行表征显得尤为重要，主要是因为元素对于工艺的潜在影响。

安捷伦快速智能的 ICP-OES 和超高信噪比的 ICP-MS，智能定量（IntelliQuant）平台可以快速对于不同培养基中的全元素进行扫描，提供的专属热力图，可以帮助实验人员更加直观的对培养基中元素差异进行辨别；全能高效的 ICP-MS 方案标配高基体引入系统（HMI），耐受盐分含量较高的培养基，兼顾高效和准确性，可以更好保证符合培养基以及抗体，疫苗的测试。

Agilent 5800 ICP-OES 系统                   Agilent 7850 ICP-MS 系统

全元素快速扫描——助力生物药研究和质量控制

Agilent 5800 ICP-OES 对于未知疫苗样品快速定性和半定量（IntelliQuant）结果，热力图（Heatmap）直观显示疫苗中铝佐剂所有元素浓度高低分布，样品组成便可“一目了然”。

Agilent 7800 ICP-MS IntelliQuant 对培养基样品的全元素扫描热力图直观显示图：

Agilent 7850 ICP-MS 培养基中主量元素分析

Na 元素作为细胞渗透压的一个重要表征；Agilent ICP-MS 可以实现 1% 级别的 Na 元素检测，对于微量元素分析的同时又实现了渗透压的监测。

Na 校正曲线范围：0.1ppm--10000ppm

Agilent 7850 ICP-MS 培养基中痕量元素锰(Mn)，硒(Se)的分析

得益于 Agilent ICP-MS 超高的灵敏度，锰（Mn）的背景等效浓度可以达到 0.4ppt；锰（Mn）是糖基化通路中多种酶的辅助因子，在培养基中如过度的补充会降低蛋白的产量以及抑 制细胞的生长，因此更好的监控锰（Mn）的含量对于细胞的生长有重要的意义。Agilent 7800 ICP-MS 具有超低浓度锰（Mn）的检出能力，可以更好满足培养基中关键元素锰（Mn）控制要求。

安捷伦独有的增强型 HEHe（High Energy Helium）模式，相对普通 He 模式下硒（Se）的灵敏度提升近五倍，同时背景也降低了一倍多，信噪比提升十倍以上。硒（Se）对细胞培养基具有解 毒的机制，同时作为 Fe 的运载体，对于细胞培养起到举足轻重的作用，无需使用氢或其他反应模式即可分析极 ppt（ng/L）级别的硒，可以更好满足培养基中硒（Se）元素的控制要求。

不同模式下硒（Se）灵敏度对比

安捷伦 7850 ICP-MS 对于培养过程监控

备注：单位：μg/L

备注：单位：μg/L

培养基中微量元素培养过程的含量变化与细胞生长密切相关，很多研究表明 Zn 对于蛋白电荷的变化有起到一定的作用。

培养基原料分析

根据细胞适用性的不同，培养基中的成分及其配比会有差异。入库鉴别需要将不同种类的培养基快速区分出来，以降低由于原料标签、分类等错误而导致的误投料风险。

拉曼光谱仪广泛应用于原辅料入库鉴别。安捷伦 Vaya 手持拉曼光谱仪性能出众，具备优异的光谱信噪比，同时搭配 R2 和 LMC 智能算法，能够有效鉴别不同培养基。下面案例用 1 号培养基建模，建立的模型分别测试了 1-9 号培养基样品， 1 号和 4 号培养基相同， 1 号和 2、3、5、6、7、8、9 号培养基不相同。1 号和 4 号测试结果为“Pass”，其他样品为“Fail”，与预期一致。

1-9 号培养基测试结果汇总如下：

2 号培养基（测试结果为 Fail）的测试图谱如下，其中紫色为模型图谱，蓝色为 2 号培养基图谱。

此外，一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。常见的固体培养基一般是装在桶中，内层有两层 PE 袋包装，也有一些直接装在不透明的塑料瓶中。对于储存在桶中的培养基，Vaya 可以透过内袋进行测试。对于不透明的塑料瓶， Vaya 可以隔着外包装直接检测。

塑料桶包装固体培养基                          塑料瓶包装固体培养基

结 语

本文介绍了安捷伦-测简奕共同开发的“细胞培养基和代谢分析完整解决方案”，从培养基原料分析、培养基成分消耗和代谢物监测以及细胞代谢研究等不同维度和水平，全方面研究和控制细胞培养过程。

本文分享了培养基原料分析、培养基成分消耗和代谢物监测两个方面的数据和案例，近期将推出 “细胞代谢研究”专 题分享。“培养基成分消耗和代谢物监测”主要监测的是培养环境的变化，而细胞生长和蛋白的表达都离不开对细胞本身功能和代谢的分析和调控。“细胞代谢研究”专 题从细胞功能和分子代谢物水平对细胞代谢做全面研究，可为培养基和工艺开发提供更为深层次的底层数据，敬请期待。