Milli-Q®讲堂 | 为什么我的PCR实验又失败了？

最近不少小伙伴和Q博士诉苦：

“为什么我的PCR实验又失败了？”

我们都知道，核酸酶通过剪切核酸骨架中的磷酸二酯键来降解DNA和RNA，在不少实验中发挥着重要作用。但是在PCR实验中，因为需要完整的生物样品信息用于PCR、克隆、测序或基因编辑等应用，研究核酸时需要不含核酸酶的试剂和容器。那么，核酸酶通过减切核酸骨架中的磷酸二酯键来降解DNA和RNA。虽然有些核酸酶是有用的研究工具，但是通常科学家需要完整的生物样品信息用于PCR、克隆、测序或基因编辑等应用。因此，研究核酸的科学家需要不含核酸酶的试剂和容器。作为缓冲液和试剂的主要成分，水中也不应该含有核酸酶。

核酸酶到底来自哪里呢？

核酸酶在实验室中普遍存在，它们普遍通常存在于塑料制品和试剂中，甚至可能来自科学家实验人员自身（皮肤，唾液等），而且核酸酶非常稳定，很难灭活。因此，经常使用DEPC处理来去除它们。

如何去除实验中的核酸酶？

DEPC是一种有效的非特异性RNA酶YZ剂，用于RNase灭活，且被应用多年。用DEPC对溶液进行化学处理是一种非常有效的方法，但它存在以下缺点：

➤ 首先，DEPC是一种疑似致癌物质，因为它可能与嘌呤发生反应，因此需要谨慎使用；

➤ 时间和能源消耗。DEPC和核酸酶之间的化学反应需要一定的时间，为了破坏DEPC，需要对溶液高压灭菌。而高压灭菌需要消耗大量的水和电。

核酸酶到底来自哪里呢？

而超滤可以作为DEPC的替代方案生产无核酸酶水，处理方法方便安全。

经过测试，超滤（Milli-Q^®Biopak终端过滤器）可以作为产生无核酸酶水的替代方法。这个过程使用中空纤维根据其孔径分离污染物。一次性滤头内含13000Da标准分子量（NMWL）的聚砜超滤纤维（如图1）。

图1：聚砜中空纤维用于Biopak^®柱中的超滤

将核糖体RNA加入每个溶液中，孵育20分钟，然后用琼脂糖凝胶进行变性条件下的电泳。如图2，当使用超滤过滤RNA酶溶液时，rRNA保持完整。同时，使用常规DEPC处理RNase溶液也能防止rRNA降解。作为对比，当RNase溶液未处理时，rRNA被降解。这表明了使用超滤去除核糖核酸RNA 酶与通过DEPC 处理灭活RNase效果相当。

图2：经过DEPC、超滤、无处理的含RNase超纯水rRNA的凝胶电泳

Milli-Q^®Biopak终端过滤器为分子生物学、生物化学和细胞培养等应用而设计，用于生产无热原、核酸酶、蛋白酶和细菌的水。为需要超纯水用于细胞培养、生物化学或分子生物学应用的科学家提供了方便而经济的解决方案。

图3：Milli-Q^®Biopak终端过滤器

课堂总结

DEPC、超滤都可以对核酸酶进行去除。但与耗时又不安全的DEPC处理方法不同，通过水纯化系统的超滤终端方式（Milli-Q^®Biopak终端过滤器）获得无核酸酶的水，是一种安全又便捷的方法。

这种方法对科研有很多好处：

■ 按需可取。有需要时，可以非常容易地生产新鲜无核酸酶的纯水。不需要提前订购瓶装无核酸酶的水，或花时间制备无核酸酶的水。

■ 低风险。不需要化学品操作。另外，由于没有在水中添加化学物质，所以没有其试剂干扰的风险。

■ 高纯度无核酸酶的水。超滤技术是从水中直接除去核酸酶，而不是仅仅使它们灭活。因为过滤终端被设计成直接连接到水纯化系统的出口，因此可以非常方便地获得无核酸酶的超纯水。