水质对 LC-MS 分析痕量荷尔蒙的重要性

前言

随着分析仪器灵敏度不断提高，超痕量的物质也很容易被检测出来，所以实验人员也越来越重视试剂的纯度。如果用含有痕量杂质的水做LC-MS流动相，或制备标样和空白样 品，会导致错误的结果或者数据分析的困难。在很多国家，从环境中（也包括水路）检测出医药产品的存在。饮用水中存在痕量荷尔蒙的报道也越来越多，而这一类化合物很难被传统的水处理方法去除。

这也影响到了LC-MS级别纯水，因为无论瓶装或直接纯化的LC-MS级别水都是由自来水制得。

目的

本文的目的是研究无论自来水有没有被痕量激素污染，制备 LC-MS 级别超纯水的实验室纯水系统的适用性。

样品制备和检测方法样品收集：

自来水：世界上多个国家自来水，包括西班牙、法国、芬兰、ZG和印度

超纯水：来自世界多个国家实验室纯水系统制备的LC-MS级别超纯水，包括西班牙、法国、芬兰、ZG和印度。

水样在运输及测试过程中必须使用硅酸盐玻璃器皿。

水纯化系统：

• 波兰和印度： Milli-Q Integral with Millipak® final filter (EMD Millipore)

• 法国： Milli-Q® Integral with LC-Pak® final filter

• ZG和西班牙：Elix® and Milli-Q® Advantage with Millipak® final filter

水纯化系统生产的超纯水质量参数：

印度：TOC: 48 ppb, Resistivity: 18.2 MΩ·cm，25C 其他国家：TOC<5ppb, 电阻率18.2 MΩ·cm ，25C 样品前处理：

使用SPE(LiChrolut® EN, EMD Millipore)或Phenomenex Strata® -X（用于西班牙样品）

• SPE活化：5mL 甲醇(LiChrosolv® LC-MS, EMD Millipore)

• 上样：15 mL/min，10 min 真空干燥

• 洗脱：3mL甲醇，蒸发至1mL

材料和方法：

 仪器：

1. LC-MS系统：HPLC：Agilent 1290

2. MS：Agilent 6420 QQQ

3. HPLC仪器参数：

• 色谱柱：Purospher® STAR RP-18 endcapped (2 μm) Hibar® HR 50-2.1 mm (EMD Millipore)

• 流速：0.5 mL/min

• 进样量：样品40 μL, 标样10 μL

• 溶剂A：含有1%乙酸的Milli-Q®超纯水

• 溶剂B：高纯度乙腈(LC-MS LiChrosolv®, EMD Millipore)

• 梯度（min, %B）：

 4. MS 参数: Capillary 4000 V, Nebulizer 37 psi, Drying gas N2, 7.5 /min, 300o C; ESI+, MRM

荷尔蒙检测：

水样品中检测出如下荷尔蒙：

结果与讨论：

从污水处理厂流出的水中检测出低浓度（ng/L）荷尔蒙，这些水被直接排放至水路中，甚至被作为饮用水。如果自来水中存在痕量荷尔蒙，就要在超纯水应用于激素类物质的检测用于制备样品和标样，以及作为LC-MS流动相和空白之前，确保能够被纯水系统除去。

使用标准加入法可以检测时9种不同的荷尔蒙。  荷尔蒙分析的方法检出限（MDL）为12-36 pg/L。

使用LC-MS/MS检测出（IDL）的荷尔蒙浓度（图1、2和3）：

• Estradiol: 法国样品 265.40 ng/L 西班牙样品 297.92 ng/L

• Androsterone: 法国样品 515 ng/L, 西班牙样品1635 ng/L*西班牙样品*( 可能样品中存在荷尔蒙类似物使得检测含量过高)

• Corticosterone: ZG样品 14.91 ng/L

相对应的，在这些水样对应的超纯水样品中并没有检测出荷尔蒙(MDL: 12-36 fg/L, IDL: 0.4-1.1 pg)

结果和讨论：

图1. 法国和西班牙自来水样品中Estradiol 的LC-MS/MS结果（左图）和Milli-Q®纯水结果对比（右图，标样为1ppm的Estradiol）

图2. 法国和西班牙自来水样品中Androsterone 的LC-MS/MS结果（左图）和Milli-Q®纯水结果对比（右图，标样为1ppm的Androsterone）

图3. 法国和西班牙自来水样品中Corticosterone 的LC-MS/MS结果（左图）和Milli-Q®纯水结果对比（右图，标样为1ppm的Corticosterone）

结论

• 自来水中可能含有痕量荷尔蒙。为了满足实验室应用要求，自来水要通过各种纯化手段制备成超纯水。

• 作为水纯化系统的进水中如果可以检测出荷尔蒙（或类似物），在超纯水系统制备的纯水中已检测不出该类物质。

• 为LC-MS/MS实验选择合适的超纯水资源可以确保得到高质量的数据。

• 可以依靠正确的安装和良好的维护纯水系统来满足实验室LC-MS/MS分析对超纯水高质量的要求。