小麦粉中硫脲的测定

2019年，国家粮食和物资储备局办公室在第330号通知[1]中公开了国家标准《小麦粉》征求意见稿，其中小麦粉的定义为：小麦粉wheat flour是指由普通小麦（六倍体小麦，Triticum aestivum L.）经过碾磨制粉，去除部分麸皮和胚并达到一定加工精度要求的、未添加任何物质的、能够满足制作面制食品要求的产品。与《关于进一步加强小麦粉质量安全监管的公告》（2017 年第132号）^[2]中关于小麦粉（通用）中添加物的要求，即“取得‘小麦粉（通用）’生产许可的企业，不得在小麦粉中添加任何食品辅料”，保持一致。

早前被允许添加之后又被禁止的过氧化苯甲酰（Dibenzoyl peroxide, BPO），在近几年的食品安全抽检中时有被检出，其非法添加的目的主要是给新生产的小麦粉脱色^[3]。然而在小麦粉的加工和储藏过程中，经常会出现颜色加深的现象，即褐变。发生褐变的主要原因是，小麦籽粒中的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）催化酚类物质氧化生成褐色或黑色的醌类物质^[4]，从而影响了小麦粉的色泽，降低了小麦粉的品质。 

根据GB 2760-2014 附录B^[5]中，对食品漂白剂的定义：能够破坏、YZ食品的发色因素，使其褪色或使食品免于褐变的物质。针对小麦粉的酶促褐变，一些不法的的商贩会通过添加具有还原性的硫脲（Thiourea）进行漂白，硫脲能够YZ多酚氧化酶的活性，阻止褐变的发生，在一定程度上将醌类还原成酚类，掩盖不好的品质，达到提亮增白的效果。而硫脲的非法添加会刺激呼吸道和肠道，YZ甲状腺和造血器官的机能，引起咳嗽、胸闷、头痛、嗜睡、无力、面色苍白、面部虚肿、基础代谢降低、血压下降、脉搏变慢、白细胞减少等症状^[6]。早在2001年，世界卫生组织国际癌症研究机构就将硫脲列在了3类致癌物清单中。

原食品药品监督管理总局于2016年发布第196号公告[7]，公布了食品补充检验方法《小麦粉中硫脲的测定 BJS 201602》，填补了国内硫脲检测标准的空白。为了进一步规范企业的生产行为，加强小麦粉质量安全监管，总局于2017年发布第132号公告^[2]，其中明确规定“严禁生产企业在小麦粉中添加过氧化苯甲酰、次磷酸钠、硫脲、间苯二酚、过硫酸盐、噻二唑、曲酸等非食品原料”。

在此背景下，赛默飞实验室对GX液相色谱法测定小麦粉中硫脲的实验条件，开展了相关研究工作。

01 样品前处理

准确称取均质小麦粉1.0 g（精确至0.01 g）于15 mL旋盖螺口圆底离心管中，加入10.00 mL 80:20乙腈水，旋紧盖子，涡旋分散30 s，水浴超声提取20 min（由于超声时间较长，水浴温度会升高，建议加入冰袋控温），10000 rpm 4℃ 冷冻离心10 min，取上清液过0.2 μm亲水PTFE微孔滤膜，滤液上机测试。

02 色谱条件

● 液相色谱仪：UltiMate™ 3000 HPLC 液相色谱系统

● 色谱柱：Syncronis™ HILIC, 250×4.6 mm, 5μm    (P/N: 97505-254630)

● 柱温：20 ℃

● 进样量：5 µL

● 流动相：A为乙腈，B为水

● 洗脱程序：A:B=90:10，等度洗脱

● 流速：1 mL/min

● 检测波长：246 nm

● 采样频率：5 Hz

● 采集时间：12 min

03 实验结果与讨论

3.1 色谱条件优化

3.1.1 色谱柱选择

硫脲标准品溶液在Syncronis HILIC色谱柱上获得了出色的峰型和优异的灵敏度。

图1. 硫脲标准品溶液色谱图（1.00 μg/mL）

3.1.2 样品溶剂的选择

在HILIC模式下，采用80:20乙腈水作为标准品稀释液时，10.0 μg/mL硫脲标准品得到了尖锐且对称的峰型。

图2. 硫脲标准品溶液色谱图（10.0 μg/mL）（A：稀释溶剂为纯水，B：稀释溶剂为80:20乙腈水）

3.1.3 柱温的选择

当色谱柱柱温选择20 ℃ 时，硫脲峰与杂质峰可达到基线分离。同时，采集时间由10 min延长至12 min，可避免11 min左右的杂质峰延迟至下一针进样时出峰。

图3. 30℃ 柱温，小麦粉空白基质和0.20 μg/mL基质加标叠加色谱图

图4. 20℃ 柱温，小麦粉空白基质和0.20 μg/mL基质加标叠加色谱图

3.2 样品前处理优化

本次试验中前处理流程为：称取1.00 g小麦粉，加入10.00 mL 80:20乙腈水（提取溶剂与标准品稀释溶剂保持一致），涡旋混匀，高速冷冻离心，取上清液过膜，上机测试。处理一批次8个样品，耗时约1小时。而标准推荐的前处理流程，在提取、过滤（离心）后，加入了旋蒸浓缩10 mL 80:20乙醇水提取液的操作，耗时较长，且样品通量小。因此优化后的前处理流程，提高了样品通量，减少了溶剂用量，效率得到提升。

3.3 线性范围、方法检出限及方法定量限

在优化的色谱条件下，硫脲标准工作液线性范围为0.20-5.00 μg/mL，线性方程y=0.9109x-0.0300，线性相关系数r²=0.99992，线性关系良好。硫脲线性方程图及标准曲线点叠加色谱图。在优化前处理条件下，硫脲方法检出限为2.0 mg/kg，定量限为5.0 mg/kg。

图5. 硫脲线性方程图及标准曲线点叠加色谱图

3.4 回收率和精密度

小麦粉基质 2.0、5.0、20.0 mg/kg 三水平加标回收率范围在 91.2%～95.0% 之间，相对标准偏差在 0.57%～2.36% 之间（n=6）

表1 小麦粉基质 2.0、5.0、20.0 mg/kg

三水平加标回收率范围和精密度

图6小麦粉基质 2.0、5.0、20.0 mg/kg 三水平加标回收率范围和精密度

图7小麦粉基质中硫脲方法检出限 MDL 浓度 (2.0 mg/kg) 加标

图8小麦粉基质中硫脲方法定量限 LOQ 浓度 (5.0 mg/kg)加标

图9小麦粉基质中硫脲10倍方法检出限浓度 (20.0 mg/kg)加标

04 结论

本方法针对食品补充检验方法《小麦粉中硫脲的测定 BJS201602》进行了优化，简化了前处理流程，优化了色谱条件，线性范围、方法检出限及定量限、加标回收率及精密度均能满足方法确认的要求。该方法简单、便捷，适用于小麦粉中非法添加物硫脲的快速测定。

参考文献：

[1] 国家粮食和物资储备局办公室. 关于《小麦》《小麦粉》国家标准公开征求意见的通知 国粮办发[2019]330号[EB/OL]. http://www.lswz.gov.cn/html/zmhd/yjzj/2019-11/11/content_247627.shtml

[2] 总局关于进一步加强小麦粉质量安全监管的公告(2017年第132号)[J]. 现代面粉工业,2017,31(06):28.

[3] 于鸿飞. 国内外小麦粉标准的差异及我国现行小麦粉标准的修订研究[D]. 西北农林科技大学,2011.

[4] 黄海霞,张真,吴金芝. 小麦多酚氧化酶特性及褐变控制研究[J]. 安徽农业科学,2008,36(31):13574-13575,13638.

[5] GB 2760-2014. 食品安全国家标准　食品添加剂使用标准[S]. 2014

[6]  焦安浩. 硫脲的危险性及安全管理措施研究[J]. 化工管理,2021(07):95-96

[7] 总局关于发布食品中那非类物质的测定和小麦粉中硫脲的测定2项检验方法的公告[J]. 中国食品卫生杂志,2017,29(01):25.

[8] Thermo Fisher Scientific Technical Guide 21003:HILIC Separations Technical Guide-A Practical Guide to HILIC Mechanisms, Method Development and Troubleshooting[A/OL]. https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets/CMD/brochures/TG-21003-HILIC-Separations-TG21003-EN.pdf . 2014