方法转移 无缝衔接

分析方法在其生命周期中会需要变更或调整以满足性能指标的要求，当在不同的实验室转移（确认的）方法时，如从研发实验室到QC实验室，或类似CRO、CMO/CDMO实验室，或者各种生物技术创新平台，需要考虑(U)HPLC仪器参数对色谱分离的影响，尤其面临仪器参数偏差，以及某些方法对偏差做出的响应时，确保液相方法在各原实验室和方法接收方的成功转移。针对补偿梯度延迟体积的差异，基于软件的GDV差异补偿，通常是通过进样事件的时间位移或梯度曲线变化的方法改变，这可能会引起监管机构的担忧。管制机构通常允许改变等度保持时间，只为模拟体积差异。基于硬件的解决方案是使用硬件来模拟GDV和混合行为， 而混合器和样品环的手动改变可能需要系统再确认。最为可选是LC系统具备连续可调GDV，有利于追踪，不需要再确认。

方法转移并不像看上去那么简单，需要考虑至关重要的仪器细节，主要因素有梯度延迟体积GDV、扩散效应、温控模式，以及不那么明显的检测器设置。

从下图可见仪器参数及其对成功的 (U)HPLC方法转移的重要性，离图形中心越远，参数越重要。重要性值是估计值，取决于分离温度，流速等方法的详细信息。

梯度延迟体积(GDV)影响梯度方法的保留时间和分离度，需要注意混合体积收缩效应和泵的混合模式不同引起的流速和梯度非线性，不同配置仪器上梯度延迟体积GDV也非恒定不变，对流速和压力的依赖性各不相同。

流动相混合体积效应：收缩体积依赖于溶剂和混合比例，LPG泵头对GDV有贡献

不同类型HPLC仪器上梯度延迟体积GDV 对流速和压力的依赖性见下图。

HPG和HPG之间的方法转移匹配 GDV 非常简单，LPG 与 LPG之间的方法转移更有挑战性（混合特性也必须匹配），最 好避免LPG和HPG之间的转移。

更换混合器是物理改变系统GDV的有效方法。缺点是它只允许根据可用的混合器体积逐步改变GDV，是一种粗调GDV方式。

Vanquish 液相色谱系统自动进样器计量泵的可设定闲置体积允许精细调节系统GDV：

1、改变泵梯度混合器，以实现 GDV逐步变化

2、满足高要求难分离时无缝调节的需要

3、不需要手动改变硬件设置

4、审计追踪和设备验证完全合规

Vanquish液相色谱系统在自动进样器中使用计量泵在进样前吸取样品。计量泵是流路的一部分，对系统的GDV有贡献。计量泵的冲洗体积可以通过柱塞的运动而改变， 这一冲洗的体积就是闲置体积，闲置体积的改变有助于GDV的无缝调节。计量泵柱塞位置对梯度延迟体积的影响。结构设计旨在确保独立于活塞位置，整个闲置腔体被冲洗，结构设计可防止在所有柱塞位置（闲置体积）和流速中出现停滞区。可以通过软件命令减少到较小体积来模拟具有较小 GDV 的系统（图 1，左图）或增加到更大的体积以模拟具有较高 GDV 的系统。设定的闲置体积和进样体积是相互独立的，即两者的任意组合是可能的。闲置体积的设置由赛默飞世尔科技变色龙色谱数据系统 （CDS） 软件审核追踪 ，因此完全可审核。         

为了进一步扩展 GDV 的灵活性，一个方法转移套件 （P/N 6036.2100） 可用于 Vanquish HPLC 系统。它由一个 2 位 6 通切换阀和一个可接入流路的 200 μL 定量管组成，是可切换的附加梯度延迟体积。

在上图旁路位置，来自泵的连接管线直接与进样器联通，类似于仪器没有安装方法转移套件。当切换阀时，定量管变成流路的一部分，管线的体积添加到系统的整体梯度延迟体积中（上图下）。

摩擦热下的UHPLC 强制空气循环与静止空气柱温控模式比较如下：

避免由预热和柱温控模式引起的热不匹配造成的分离度的损失。

柱外体积ECV包括柱前和柱后体积，后者主要来自流通池体积，其影响大小取决于色谱柱的尺寸，Viper零死体积接头有助于减小ECV。

样品溶剂不匹配会造成峰变形和分离度损失：

当样品溶剂（100%甲醇）强度高于洗脱液（50：50水/乙腈）时需要减少进样体积。使用UDP用户自定义进样程序功能可实现缓解溶剂效应，大体积进样、在线衍生等功能，帮助用户对设备实施精 准操控，更能令方法转移后的谱图质量超越原谱图质量。

使用1 mm 内径色谱柱等度分离标准品化合物，使用高灵敏度的60 mm 流通池 (蓝色标记) 和低扩散流通池 (红色标记)，可见使用大体积流通池时分析物峰扩展和分离度损失。当色谱柱尺寸保持不变时，适用流通池体积选择为10%峰体积这一原则。