动物性食品中尼卡巴嗪残留标志物测定的前处理方法

尼卡巴嗪的危害及检测目的

尼卡巴嗪（Nicarbazin）又名球虫净，1955年由美国Merck公司开发，具有GX、广谱抗球虫活性，预防效果很好，且耐药性发展极慢，至今仍然是最有效的抗球虫药之一。尼卡巴嗪是4,4’-二硝基均二苯脲（DNC）与2-羟基-4,6-二甲基嘧啶（HDP）的复合物。HDP在动物体内由尿液排出，代谢迅速。而DNC通过粪便排出，代谢缓慢，因而在肌肉及其他组织中会出现不同程度的残留，人们食用后会产生潜在危害。联合国粮农组织以及新西兰、日本和我国等均以DNC单体作为尼卡巴嗪的残留标志物。为规范尼卡巴嗪在养殖鸡群中的用药，2020年我国生效实施的GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药ZD残留限量》中规定了DNC在肉鸡不同组织中的ZD残留限量。

本文阐述了如何将4,4’-二硝基均二苯脲（DNC）从样品基质中分离提取出来，并经过净化后，转化成液质联用仪可以检测的形式。以提取、净化为ZD，依据国标GB 29690-2013，为检测人员和相关领域研究人员提供一定的参考。

检测项目：4,4’-二硝基均二苯脲（DNC）

应用范围：鸡肌肉/鸡蛋

液相色谱-质谱/质谱法

方法原理：试料中残留的4,4’-二硝基均二苯脲，用乙腈提取，正己烷除脂，75 %甲醇水溶液萃取，液相色谱-质谱/质谱法测定，内标法定量。

前处理仪器：

分析天平（感量0.00001 g和0.01 g）；涡旋振荡器；离心机；氮吹仪；离心管（50 mL）；滤膜（0.2 μm）。

检测仪器：LC-MS/MS+ESI源

试样制备与保存

1.鸡蛋

取适量新鲜或冷藏的空白或供试鸡蛋，去壳，并使均质。零下20 ℃以下保存。

取均质后的供试样品，作为供试试料；

取均质后的空白样品，作为空白试料；

取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。

2.鸡肌肉

取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。零下20 ℃以下保存。

取均质后的供试样品，作为供试试料；

取均质后的空白样品，作为空白试料；

取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。

前处理方法

提取与净化

称取试料2 g±0.02 g，于50 mL离心管中，添加10 μg/mL 4,4’-二硝基均二苯脲-D8标准工作液适量，加无水硫酸钠2 g，乙腈8 mL，涡旋0.5 min，超声5 min，5000 r/min离心10 min，取上清液，于40 ℃氮气吹干，加75 %甲醇水溶液饱和的正己烷1 mL，涡旋10 s，再加75 %甲醇水溶液1.0 mL，充分涡旋混合，于40 ℃水浴中静置5 min，2000 r/min离心5 min，取下层清液，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。

国标解读及注意事项

1.DNC标准物质用二甲基甲酰胺配成1 mg/mL的标准储备液，在2 ℃-8 ℃保存，可使用3个月；DNC-D8标准物质用二甲基甲酰胺配成1 mg/mL的标准储备液，在2 ℃-8 ℃保存，可使用3个月。

2.前处理过程中使用乙腈提取目标化合物，无水硫酸钠除水，正己烷除脂。

3.前处理过程中注意控制水浴温度不超过40 ℃，防止目标化合物降解。

4.上清液浓缩后，加入正己烷和定容液，需要充分涡旋混合进行液液分配萃取，保证除脂效果；水浴静置过程中观察分层情况，可以适当延长静置时间，保证水相与有机相分离完全。

5.同位素内标加入量决定ZZ定容后的理论上机浓度，务必与配制的标准曲线中各点同位素的浓度相一致，才能正确校正回收率。

6.液质联用仪负离子扫描检测，为保证检测灵敏度，建议正负离子扫描分开仪器进行。

参考文献

GB 29690-2013 食品安全国家标准 动物性食品中尼卡巴嗪残留标志物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法