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干货丨标准曲线经典十问十答,助您搞定标准曲线!

发布:上海安谱实验科技股份有限公司
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最近实验很糟心,标准曲线弄不清。一条要拉几个点、浓度范围怎么选。线性需要几个九、期间核查有没有……


的确,大家在标准曲线的制作过程中会有很多的问题,今天小编就带大家全面的了解标准曲线的制作规则。一起来看看吧!

01

Q:什么是校准曲线?

A:标准曲线就是我们平常大家操作得最多的,把标准品稀释成不同的浓度点,直接上机测试,绘制曲线用于定量。但是如果样品经过复杂的前处理,比如消解,萃取或者净化等过程,那么目标化合物就会有一定的损耗,用标准曲线来定量是不准确的,我们就可以用工作曲线。工作曲线就是所使用的标准物质溶液经过与样品相同的前处理,这样就可以尽量减少前处理带来的计算误差了。

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02

Q:标准曲线要做几个点?

A:标准曲线需要几个数据点,与所检测组分的浓度范围、检测信号响应类型、仪器的灵敏度和分辨率都有关。

对于一些低浓度,特别是痕量分析,比如二噁英、多氯联苯等等,有些样品的含量在ppb级别,且浓度范围不是很大,检测器响应可靠,背景干扰非常小的,可以选用较少的工作点,有的选三个浓度点就可以了,有的甚至可以只用一个浓度点,另一个点直接用坐标原点。

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但是对于一些样品浓度范围较宽的,比如顶空法测一些样品中的苯系物的项目,样品的浓度范围变化很大,所以标曲的浓度范围设置很宽,但是检测器的响应与浓度的关系不是一条直线,也就是说不是一次方程,这时可以采用分段校准的方式。有的项目比如说GPC测分子量分布的,由于受到色谱柱工艺等条件的限制,很难做到线性,经常用三次方程拟合,如果拟合的曲线达不到三个九也会做五次方程的拟合。这几种情况下就需要根据需要多做几个数据点。

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当然在各项拟合指标合格的情况下,采用一次方程更符合统计学上参数最少的统计简洁性原则。

补充:如果是分段校正,则每段需要至少两个数据点。而对于一些样品无浓度范围规律的,特别是一些检测机构,如果分析仪的检测响应可靠,环境因素影响少的,可以做校正曲线。若是环境因素影响大的,则不必做校正曲线,而采用标准加入法反而简便一些,比如阳极溶出伏安法测样品浓度。


03

Q:标准曲线为什么常见的是奇数个点?

A:其实标准曲线做几个点,点分布如何,影响的是测试结果的不确定度。

好的测量应该是不确定度小的,这在判断样品的结果是否超标或是否符合限值的时候至关重要。

我们在推算样品的不确定度时,有两个结论:一、标曲的重心点处,所查出来的样品不确定度最小。二、标曲的点数越多,样品的不确定度越小。所以在样品浓度的附近应尽量多的分布标准点。奇数点的设置就是先通过已知信息来确定浓度范围,在该浓度范围内先确定中间点,然后在中间点左右分布对称的标准点,所以做出来的标曲常常是奇数个点。


04

Q:标准曲线浓度点如何设置?

A:对于我们分析实验室的一些常规理化性质的测试,一般标准曲线的第一个点是检出限的5~10倍。以后根据一倍递增,zui高浓度是最低浓度的10~20倍为宜。对于浓度范围宽的曲线,递增的倍数会更大,比如三倍,五倍等。这个也是要根据仪器的灵敏度来调整的。


05

Q:一元标准曲线方程各参数是什么意思?

A:一元标准曲线方程y=a+bx,r2 。 其中x表示化合物浓度,y表示化合物在仪器上的响应,a表示在y轴上的截距,b表示曲线的斜率,1/b 表示化合物的响应因子。响应因子可以简单快速的判断化合物配制的准确性和仪器的稳定性,比如氘灯的能量是否正常。r表示x与y的相关系数:r越接近于1,正向相关性越好,r越接近于-1,负向相关性越好,r越接近于0,相关性越差。r2 表示判定系数,是一个统计学概念,当根据试验数据进行曲线拟合时,试验数据与拟合函数之间的吻合程度,用一个与相关系数有关的一个量r2来评价:r2值越接近1,吻合程度越高,越接近0,则吻合程度越低。


06

Q:标准曲线r2值需要几个9才合格?

A:实验室应按检测标准(方法)的要求使用标准溶液或标准物质建立标准曲线。所用标准溶液或标准物质应覆盖被测样品的浓度范围。检测标准(方法)如无具体的要求,至少使用5个标样(除空白外)建立线性标准曲线,每个点重复测定1-3次,对于筛选方法,线性回归方程的相关系数不应低于0.98,对于确证方法,相关系数不应低于0.99。

其实,大于0.99是判断是否为线性相关的一个标准,实际应用中线性大于0.999才是比较理想的。线性在0.99到0.999之间的监测结果只用接近最高浓度一半(中间浓度)的位置才比较准确,如果线性大于0.999的话,在整个线性范围内都会有一个比较满意的结果。

如果检测的线性不好,可以减少标准的覆盖范围,将标准的浓度调整到待测样品浓度附近,这样结果也是非常准确的。例如,样品的浓度约20ppb,但在0~50ppb范围建立标准曲线,但线性非常不理想,这时可以将标准范围调整到15~25ppb之间,作五个标准。


07

Q:相关系数的有效数字?

A:GB5750.3-2006 8.2.7项有如下规定:校准曲线相关系数只舍不入,保留到小数点后出现非9的一位,如0.99989→0.9998。如果小数点后都是9时,最多保留小数点后4位。


08

Q:标准曲线有效期有什么规定?

A:我们做好了一次曲线,我们还要保证以后每一次曲线,每一次定量都是准确的,这样就要做标准物质的期间核查。

(1)标准曲线属于实验室质量控制的范围,按照《实验室资质认定评审准则》中结果控制的要求:定期使用有证标准物质(参考物质)进行监控和/或使用次级标准物质(参考物质)开展内部质量控制。

(2)准则中并未对“定期”进行规定,所以如果“定期”,就根据实验室的实际情况来定了。

(3)既然准则上没说明,那根据一般的分析教材,当实验条件(包括药剂、人员、仪器等)发生变化时,zui好重新制作标准曲线。


09

Q:标准曲线能不能长期使用?

A:这就涉及到仪器的期间核查,要用标准曲线的质控点进行核查。每批样品应测定一个校准曲线中间点浓度的标准液,其测定浓度与校准曲线标准点的浓度相对误差不得超过规定范围,如果超过规定相对误差,需重新绘制校准曲线。

也可以这样说,不同的分析项目,不同的分析方法,校准曲线斜率的稳定性不同。如校准曲线的斜率较为稳定,则在样品分析时,可只测定两个标准点,当此两个标准点与原曲线相应点的相对偏差均小于5%时,可使用原校准曲线。因此,样品分析前,需根据斜率的稳定性来确定是否需同时制作校准曲线。

我们一般的做法是,根据检测的频率来做,如果该项目天天都要检测,并且检测量较多时,要求至少每周做一次曲线。如果检测量上,一个月都没有几单的话,就一个月做一次曲线。当然,仪器如果出现故障并大修后回来的,经过检定后,需要重新做曲线。


10

Q:标准曲线是否必须过原点?

A:标准曲线不一定非要过原点,只要线性好就可以了。因为做空白的话基本上不会过原点。过原点是强制过的,实际曲线可能不过,就会造成误差。不过原点是因为有系统误差。

针对是否过原点(0,0)问题,可以从原点(0,0)代表的意义来考虑:

即所测组分浓度为零的时候,信号响应值(液相色谱也就是峰高或者峰面积)是否也为零。通常来说色谱分析是属于这种情况的,因而可以把(0,0)点作为一个浓度水平计入标准曲线(甚至不需要真的去配一个浓度为零的标准溶液来进样),这也是单点法定量的一个依据;而类似的情况在光谱法测定时就讲不通了,浓度为零的标准溶液(本底)响应信号(吸光度)往往不是零,这个时候标准曲线就不一定过原点了。


总结

了解各个分析项目校准曲线斜率的稳定性及影响稳定性的主要因素,可决定是否能采用质控点检验原校准曲线,省略重新制作校准曲线;从校准曲线斜率的变化,可判断标准溶液的稳定性,从而确定其标定周期;分析低浓度样品时,应使用高纯度的水和试剂,以减少空白值,降低样品的分析误差。

科学地运用校准曲线,对于降低分析成本、提高检测质量有着重要的意义。


2020-07-29
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