光子桥接多光子激发显微镜的基础知识

       光子桥接双光子激发显微镜（也称为非线性、多光子或双光子激光扫描显微镜）是共聚焦和去卷积显微镜的替代品，可为三维成像提供独特的优势。特别是，双光子激发在活细胞成像方面表现出色，尤其是在完整组织内，如脑切片、胚胎、整个器官，甚至整个动物。荧光显微镜的有效灵敏度，尤其是厚标本，通常受到离焦眩光的限制。这种限制在共聚焦中大大减少显微镜，通过使用共焦针孔来拒绝离焦背景荧光并产生薄（小于 1 微米）、不模糊的光学切片。或者，去卷积显微镜使用传统显微镜使用光学系统的测量点扩散函数以数字方式重建图像。

       光子桥接多光子激发的基本物理原理，并讨论了其在激光扫描显微镜中使用的优势和局限性。强调了实际考虑，以说明该技术的实用性并展示其一些物理限制。最 后，讨论了双光子激发显微镜的选定应用，以说明该技术如何允许进行其他方式无法进行的实验。 

       在进行任何光学切片实验之前，应仔细考虑选择最适合为所研究问题提供答案的技术。对于相对较厚样品的荧光显微镜，双光子激发通常提供最合适的解决方案，尽管互补的三维荧光显微镜方法具有特殊的好处，使它们在某些实验中具有优势。 

       光子桥接共聚焦显微镜利用针孔从检测中排除离焦背景荧光。因此，该技术允许对更厚的组织进行三维切片。然而，激发光会产生荧光，从而在整个样本中产生光漂白和光毒性，即使信号仅从焦平面内收集。这种大的激发体积会导致显着的光漂白和光毒性问题，尤其是在活标本中。此外，共聚焦显微镜的穿透深度受到整个光束路径中激发能量的吸收以及激发和发射光子的样本散射的限制。 

       去卷积技术通常为散焦背景相对较低的标本或整体信号水平较低的标本提供最 佳解决方案。由于去卷积方法采用传统的宽视野显微镜进行图像采集，因此激发强度通常保持在较低水平。因此，去卷积对于活细胞的单层成像通常是有效的。然而，重要的是要认识到，许多所谓的反卷积方法只是不生成定量数据的非线性数据过滤器。只有真正的约束迭代反卷积技术产生可用于进一步分析的定量数据。然而，由于离焦背景和光散射增加，在宽场荧光显微镜上进行的去卷积对厚样品的渗透有限。此外，由于繁重的计算要求，反卷积图像无法在实验过程中提供即时反馈。 

        双光子激发提供了在焦点平面上方和下方没有吸收（这会导致光漂白和光毒性）的三维光学切片。因此，与共聚焦显微镜相比，该技术提供了更高的深度穿透，并且对活体标本的光毒性较小。因此，双光子激发显微镜优先于其他技术用于需要深入穿透活组织或完整动物标本的实验，并且可以从各种制造商处获得交钥匙系统，包括尼康A1 MP+/A1R MP+. 然而，由于控制双光子激发的光物理学不同于传统的荧光激发，某些荧光团的双光子激发偶尔会观察到有害影响，这反过来限制了这种方法在薄样品中进行光学切片的适用性。