TDG蛋白;胸苷嘧啶DNA糖基化酶(TDG)重组蛋白
英文名称:Recombinant Thymine DNA Glycosylase (TDG)
G/T Mismatch-Specific Thymine DNA Glycosylase; Thymine-DNA glycosylase
来源:原核表达
宿主:E.coli
规格:10μg 50μg 200μg 1mg 5mg
内毒素水平:<1.0EU/μg(LAL法测定)具体详见说明书
片段与标签:N-terminal His Tag
物种来源(人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猕猴、山羊、绵羊、马、牛、猪、鸡、狗等其他物种多物种)相同的名称,不同的物种。
性状:冻干粉
表达系统: 大肠杆菌
产品纯度:>95%-98%(SDS-PAGE & RP-HPLC)
保存条件:如果样品在2-4周内使用,可以在4°C低温储存。
TDG蛋白;胸苷嘧啶DNA糖基化酶(TDG)重组蛋白有几个疑点:
1、表达量如何?
2、超声过程中注意冰水浴了吗?
3、“蛋白条带由1条变成3条”是不是说表达后的全菌电泳目标蛋白是一条带,而在超声或溶菌酶处理后这1条带降解成了3条?
4、降解成的3条带中还有原来的融合蛋白条带吗,量如何?
5、变性纯化后的纯度如何?
6、能否把相关电泳图发上来看看?
答:蛋白表达量不高,但也不低;
超声过程一直是在冰上进行的;
全菌电泳目的蛋白是一条带;
降解成3条带后,大部分情况下是有目的融合蛋白的,量比较少;
变性纯化后纯度还是挺不错的。
TDG蛋白;胸苷嘧啶DNA糖基化酶(TDG)重组蛋白两个建议:
1、用非变性纯化样品去做EK酶切、纯化。
如果融合蛋白的降解是从N端开始的,而C端没有降解,那么应该能够拿到38肽。
我曾经有个这么个类似情况,酶切后证实是N端降解,C端的目的蛋白好好的,大小都对。
做EK酶切多了,往往会发现,PET32a的融合段硫氧还蛋白加histag部分确实易被进一步酶切水解。但Ni柱的结合特性不变,说明水解是从N端开始的。
先做酶切梯度,电泳确定酶量标准。不要用酶说明书的量,有时候差距非常大。和蛋白种类相关。
酶切后的纯化方法选Ni柱穿透纯化,可能要加少许咪唑及盐,以利用酶切后的目标蛋白不吸附Ni柱。
2、用变性纯化的样品做复性处理
TDG蛋白;胸苷嘧啶DNA糖基化酶(TDG)重组蛋白变性纯化的样品纯度不错,查阅一下有关的复性方法资料,设计一个方案。
你用超滤和透析的方法都失败了,可以考虑用稀释的方法,控制终蛋白浓度小于0.1mg/ml,蠕动泵滴入搅拌的稀释液中,pH控制高的,如pH9-10,适当加一些甘油和EDTA,DTT。
影响蛋白原核表达的因素很多,如蛋白的亲水性、密码子的稀有性、蛋白毒性等。如疏水性过强,就难以表达;稀有密码子过多或多个稀有密码子连在一起也难以表达。我以前也遇到过这种情况,首先要分析你的蛋白序列和二级结构,看看是否存在这些影响因素。如果必须要表达全长蛋白,像你这种情况难度就比较大,可以进行密码子的改造,或者更换载体,或者更换宿主菌。看你试验的目的,如果不需要表达全长蛋白,如表达部分抗原性强的片段,可以简单一点,表达部分片段即可。
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