新技术准确定量罕见的mtDNA缺失

内容节点: 概述; 实验/设备条件; 样品提取; 实验/操作方法; 实验结果/结论; 仪器/耗材清单

新技术准确定量罕见的mtDNA缺失 Fred Hutchinson癌症研究ZX的研究人员近日发现了一种新工具，能够准确分析与多种疾病和衰老相关的极罕见线粒体DNA缺失这项成果在线发表于Aging Cell杂志上 mtDNA突变的积累与衰老神经肌肉疾病和癌症有着密切的关联然而，目前的方法无法准确定量和鉴定新的缺失事件，因其发生频率非常低，正常组织中每1亿个线粒体基因组约有一个缺失事件为了解决这些限制，研究人员开发出一种基于ddPCR的分析方法，来高分辨率地分析这些罕见缺失他们将这种方法称为数字缺失检测（Digital Deletion Detection），简称3D 文章的通讯作者Jason Bielas博士谈道：研究mtDNA突变是极其困难的，更不用说缺失我们的3D检测在特异性灵敏度和准确性上与传统方法相比有了明显的改善微滴式数字PCR所带来的通量增加让分析时间从数月缩短至数天若没有这一技术，我们无法获得这一发现 Bielas博士指的是Bio-Rad的QX100™ ddPCR系统利用这一系统，研究小组分析了80亿个人类脑mtDNA基因组，并鉴定出超过10万个带有缺失的基因组他们发现，与流行的看法相反，大多数mtDNA缺失的增加并不是由新的缺失引起的，而是之前缺失的扩增他们推测，现有突变的扩增应当是造成mtDNA缺失积累的主要因素 3D是一个新颖的三步法过程，包括富集带有缺失的分子；基因组被分成单分子液滴，并通过ddPCR定量；利用新一代测序确定断裂点 富集完成后，通过QX100系统调整液滴中的分子浓度，让大多数液滴不含有突变基因组，而少数只有一个这一过程允许每个缺失被无偏向地放大，而不会像qPCR那样引入误差 在扩增后，Bielas及他的小组利用ddPCR确定突变分子的浓度根据液滴荧光和扩增子大小之间的关系，他们能够鉴定大脑样品中罕见缺失的大小和复杂性（到底是几个克隆的扩增，还是大量随机缺失） 研究人员认为，3D检测作为一种重要的新工具，将有助于更好地研究缺失形成和扩增的机制，以及它们在衰老中的作用而微滴式数字PCR的高通量和高灵敏度也让Bielas博士的实验室能够靶定骨骼肌脑组织和血液中其他低水平的致病mtDNA缺失