考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度

内容节点: 概述; 实验/设备条件; 样品提取; 实验/操作方法; 实验结果/结论; 仪器/耗材清单

考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度

实验原理
双缩脲法（Biuret法）和Folin酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用这一方法是目前灵敏度Z高的蛋白质测定法
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的Zda吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其Zdi蛋白质检测量可达1mg这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多
（2）测定快速简便，只需加一种试剂完成一个样品的测定，只需要5分钟左右由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性**因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间
（3）干扰物质少如干扰Lowry法的K+Na+Mg2+离子Tris缓冲液糖和蔗糖甘油巯基乙醇EDTA等均不干扰此测定法
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂 Triton X-100十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度