在 FlexStation 3 读板机上使用 FLIPR Calcium 6 和 6-QF 检测试剂盒进行钙信号通路测定

简介
来 自 Molecular Devices 公 司 的 FLIPRCalcium 检测试剂盒使用敏感的钙指示剂和专有的掩蔽染料，使研究人员能够对 G蛋白偶联受体 (GPCRs)、离子通道和其他钙敏感靶点进行高度敏感的荧光筛选。通过使用一种新的染料配方来进一步增强钙流检测信号窗口，提高了测定的稳定性，同时提供了更高的测定方案灵活性。因此，FLIPR Calcium 6 和 Calcium 6-QF 钙试剂盒染料更适合于使用 16 通道移液头以中等通量的 FlexStation3 多功能微孔板读板机测量 384 孔板中的钙流。结果与 FLIPRTetra 系统在高通量模式下获得的结果相似。
检测原理
如 图 1 所 示 , FLIPR Calcium 6 检 测 染 料进入细胞的胞质中。掩蔽技术不进入细胞，但显著减少了来自残留细胞外的钙指示剂、培养基和其他成分的背景荧光。FLIPRCalcium 6-QF 检测试剂盒配方不含掩蔽技术，为淬灭敏感的靶标或多色应用提供了一种新的、灵活的选择。提供了额外的检测灵活性，在检测中使用丙磺舒的要求最小到没有要求。某些细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞系中有一种阴离子交换蛋白，需要使用阴离子再摄取抑制剂，如丙磺舒，才能在胞质中保留常用的钙指示剂。独特的 FLIPR Calcium 6 检测试剂盒染料配方对此类有机阴离子转运体具有更强的抗性，因此可能需要较少或不需要丙磺舒。

材料和方法
使用新的 FLIPR Calcium 6 和 Calcium 6-QF检测试剂盒开发了检测 HeLa 细胞中表达的内源性组胺受体的方法，然后与其他商业上可用的试剂盒进行比较。采用‘Flex’读数模式在 FlexStation 3 读板机上测定钙流。将保存在连续培养中的 HeLa 细胞以5000 个细胞 / 孔接种在含有 50 µL 生长培养基的黑壁、底透的 384 孔微孔板中，然后在 37℃、95% 湿度和 5% CO2 下过夜。第二天，细胞培养板按照制造商的建议 ( 包括水溶性丙磺舒 ) 加入适当的钙试剂盒试剂，并根据制造商的方案孵育 60 或 120 分钟。

优势
• 相比其他的钙试剂和染料提供了最大的信号窗口
• 可对包括内源性、原代或干细胞靶标进行弱信号筛选
• 专利的一步法方案所使用的掩蔽技术大大减少了细胞外背景
• 对有机离子转运体的抗性可使对阴离子再摄取抑制剂的需求最小化

使用 FlexStation 3 读板机集成的 16 通道移液器，用不同浓度的组胺 ( 从 100 µM 开始， 3 倍稀释 ) 对细胞提出挑战。使用优化的参数在化合物添加前中后进行 60 秒的荧光测定 ( 表 1 )。在拮抗剂研究中，使用FlexStation 3 读板机 的机载移液系统加入嘧啶和利培酮 ( 从 30 µM 开 始，3 倍稀释 )，并允许平衡 30 分钟。然后用 15 µL/孔的组胺 ( EC80 浓度 ) 刺激细胞，同时实时监测荧光强度的变化。
比较所用的钙指标是：
• FLIPR Calcium 6 检测试剂盒(Molecular Devices)
• FLIPR Calcium 6-QF 检测试剂盒(Molecular Devices)
• Fluo-4 Direct Calcium 检测试剂盒(Life Technologies)
FlexStation 3 读板机设置
细胞板在 FlexStation 3 读板机中维持37℃。将化合物准备在 Greiner 384 孔聚苯乙烯深孔板中，用 FlexStation 3 移液头( 黑色 ) 进行化合物转移。具体参数见表 1。
结果和分析
以峰值荧光强度测定响应。为了便于比较，将数据归一化为基线上的 % 响应，并表示为 n = 4 的平均 ± 标准差。使用 SoftMax®
Pro 软件将各组浓度响应数据拟合到四参
数曲线上 ( 图 2-5 )。