在 FlexStation 3 读板机上使用冷冻 CHO 细胞优化毒蕈碱 M3 受体检测

简介
基于细胞的检测往往具有挑战性和耗费时间。为了促进和简化这一复杂的过程，冷冻细胞，可以在没有事先培养的情况下进行检测，已经成为一种适合和经常使用的替代细胞在持续生长的培养方式。冷冻细胞使细胞培养与功能测试分离，有助于减轻生物变异性，提高孔板与孔板之间的一致性和数据保真度，增加测定时间的灵活性，显著降低细胞培养成本。
FLIPR Calcium 5 检 测 试 剂 盒 ( 图 1 )比其他“ 免洗 ”钙试剂表现出更 好的性能，并具有广泛的适用性，适用于各种生物靶点的选择。消除通常的洗涤步骤具有减少孔板处理和更快的检测通量的关键优势。此外，在次最优分析条件下，使用均相实验具有增强数据质量和降低孔间变异性的潜力。
FlexStation3 多功能微孔板读板机通过直接将试剂从源孔板转移到读数孔板，为基于分液器的系统提供了更多的灵活性，从而减少了试剂和耗材的消耗。确定单个试剂和浓度的能力可以在单个实验中探索更多的检测条件，并使该系统成为激动剂和拮抗剂研究的理想选择。

在本应用文献中，我们利用 FlexStation 3读 板机在具有代表性的 Gq-GPCR 检 测中比较不同的 Ca2+ 指标 ( 包括单波长和双波长 )，以突出使用均相的“ 免洗 ”钙试剂的潜在优势。此外，我们还比较了连续培养中的细胞和用冷冻试剂制备的细胞 ( 从European Collection of Cell Cultures(ECACC) 中获得的“ 检测就绪 ”细胞 ) 之间的检测性能和数据保真度。

优势
• 多用途检测在多种生物靶标上具有广泛的适用性
• 均相格式减少了孔板处理并提供了更高的通量
• 多通道液体处理使激动剂和拮抗剂的研究易于建立

材料和方法
• FlexStation 3 多功能微孔板读板机(Molecular Devices)
• AquaMax® 4000 微孔板洗板机，安装有96 孔洗头 (Molecular Devices)
• ImageXpress® Micro 宽场高内涵筛选系统 (Molecular Devices)
• FLIPR Calcium 5 Assay Explorer 试剂盒(Molecular Devices, Cat. #R8185)
• Fluo-4 AM (Invitrogen, Cat. #F-14201)
• Fura-2 AM (Invitrogen, Cat. #F-1221)
• DAPI 核酸染料(Invitrogen, Cat. #D-1306)
• 冷冻保存的表达人毒蕈碱 M3 受体的“ 检测就绪 ”CHO 细胞 (CHRM3, ECACC,Cat. #10031603)
• 水溶性丙磺舒(Invitrogen, Cat. #P-36400)
• CHO 细胞生长培养基： 含有 10% FBS和 1% pen/strep 的 Hams F12: DMEM培养基 (Invitrogen, Cat. #31331-093,16140-071 and 15140-122)
• 含有钙离子和镁离子以及 20 mMHEPES 的 Hanks 平 衡 盐 溶 液 (HBSS)(Invitrogen, Cat. #14025-050 和 15630-
056)
• 细胞培养板 ( 黑壁、底透 96 孔 CellBIND微孔板 , Corning, Cat. #3340)
• 乙酰胆碱，非选择性毒蕈碱受体激动剂(ACh, Sigma, Cat. #A6500)
• 对氟六氢 - 西拉 - 二芬尼多盐酸盐(p-Fluorohexahydro-sila-difenidolHydrochloride), 毒蕈碱受体拮抗剂(p-F-HHSiD, Sigma, Cat. #H127)
• 甲醇 (Sigma, Cat. #179337)
方法
细胞处理和接种方法
1. 连续培养的表达毒蕈碱 M3 受体(CHRM3) 的 CHO 细胞在 200 µL 生长培养基中以 30,000 细胞 / 孔接种，在实验台室温下维持 30 分钟，然后 37℃、95%湿度和 5% CO2 下孵育过夜。
2.“ 检测就绪 ” 冻存的 CHRM3 细胞在37 ℃ 水浴下快速解冻， 轻轻转移到 10mL 温暖的生长培养基中并以 1000 rpm离心 5 分钟。细胞重悬于生长培养基中并以 50,000 细胞 / 孔接种于 200 µL 培养基中，孔板留在实验台室温下 30 分钟，之后再 37 ℃、95% 湿度和 5% CO2 下孵育 18 小时。

3. 冻存的 CHRM3 细胞在 37℃ 水浴下快速解冻，轻轻转移到 10 mL 温暖的生长培养基中并以 1000 rpm 离心 5 分钟。细胞重悬于 10 mL 温暖的生长培养基中，然后放回 CO2 孵箱中孵育 60 分钟。接着离心后的细胞重悬于 FLIPR Calcium 5 检测试剂中并以 75,000 细胞 / 孔接种在 100 µL上样缓冲液 (loading buffer) 中。最后，细胞板用 1000 rpm 离心 ( 没有停转 ) 再在 CO2 孵箱孵育 45 分钟。

FLIPR Calcium 5 检测试剂上样染料上样

缓冲液的制备是通过将 一小管染料的完全溶解，使最终体积 为 20 mL的 Hanks 平衡盐溶液 (Hanks BalancedSalt Solution)，用 20 mM HEPES、2.5 mM丙磺舒调节至 pH 7.4。用细胞制备方法(1) 和 (2) 制备的细胞板，从孵箱中取出，移去生长培养基并加入 100 µL 染料上样缓冲液到各个孔。染料上样板在 37℃、5% CO2 下孵育 45 分钟并允许在检测前室温下平衡 15 分钟。染料上样后不用洗涤且每孔的初始检测体积为 100 µL。

Fluo-4 AM 和 Fura-2 AM 染料上样

根据上述方法 (2) 制备的细胞用 100 µL/孔 的 Fluo-4 AM 或 Fura-2 AM ( 2.5 µM 中加入 2.5 mM 丙磺舒 ) 在 37 ℃ 下 孵育 45分钟，接着吸去生长培养基。然后在安装有 96 孔细胞洗 的 AquaMax 4000 微孔板洗板机上用加有 2.5 mM 丙磺舒的HBSS 缓冲液洗涤细胞板。洗涤程序包括了一系列程序化的吸液和分液步骤 ( 表 1 )。

在 ImageXpress Micro 系统上进行细胞数量确认

为染料对比测试来验证细胞数量和融合度，用上述细胞方法 (2) 制备的培养板用 DAPI 核酸染料染色，在 ImageXpress

Micro 宽场高内涵筛选系统上成像。简而言之，制备不同密度的细胞并在 37℃、95% 湿度和 5% CO2 下孵育 18 小时。去除生长培养基，代以 100 µL 每孔 的冰冷甲醇。5 分钟后移去甲醇，加入 100 µL每孔的 DAPI 溶液 (300 nM)， 孵育 5 分钟后用 HBSS 清洗三次。 接下来用 4X物镜对细胞单层成像以测量整孔面积，用 MetaXpress软件的 Count NucleiApplication Module( 核计数应用模块 ) 得出每孔总细胞数。
细胞优化实验
为比较三种不同的细胞处理方法，乙酰胆碱 (ACh) 激 动 剂 响 应 曲 线 和 p-F-HHSiD拮抗剂抑制曲线以定性和定量方式进行比较。在染料孵育和室温平衡后，在室温下进行钙动员检测。在 3X 终浓度下、HBSS 缓冲液和 96 孔聚丙烯孔板中制备乙酰胆碱 (ACh) 稀释系列 ( 检测浓度 0.03nM–300 nM )，以 50 µL/ 孔加入到细胞板的各个孔中以刺激胞内 Ca2+ 的释放。对于拮抗剂的研究，以 3X 浓度制备 p-FHHSiD 并离线加入 15 分钟后添加 50 µL4X 浓度的 ACh

(EC80)。在化合物添加前、中、后检测荧光 90 秒。

钙指示剂对比实验
在 FlexStation 3 读板机上用‘Flex’读数模式测定钙流。加入了 FLIPR Calcium 5检测试剂、Fluo-4 AM 或 Fura-2 AM 的细胞，用整合了 8 通道移液器的 FlexStation3 读板机以不同浓度 ACh ( 20 pM 到 8µM，5 倍稀释 ) 对细胞进行挑战。用优化后的参数在化合物添加前、中、后测定荧光 90 秒 ( 表 2 )。
对于拮抗剂的研究，p-F-HHSiD 手工添加到合适的孔中并允许平衡 15 分钟再将孔板放入 FlexStation 3 中。仪器中的 机载移液系统用于 50 µL/ 孔的 Ach 分液 ( EC80浓度 )，与此同时实时监测荧光的变化。