如何在 SpectraMax iD3 和 iD5 微孔读板机上优化 Transcreener FI 检测

介绍
Transcreener HTS 是一种通用的，高通量的生化测定平台，该测定法是基于二磷酸核苷酸 (ADP/GDP) 的检测，二磷酸核苷酸可由数千种激酶催化而形成，其中很多激酶的催化共价调节反应对细胞的信号传导至关重要，并作为靶标在药物发现中具有重要价值。
TranscreenerFI 测定法是一步竞争性免疫测定法，直接检测带有红色荧光 (FI) 的核苷酸的荧光强度。该测定体系中使用的是与高特异性单克隆抗体 - 淬灭剂偶联物结合的红色示踪剂。目标酶产生的二磷酸核苷酸置换了抗体 - 淬灭剂偶联物中的示踪剂，导致荧光强度增加 ( 图 1 )。 使用红色示踪剂可最大程度地减少荧光化合物和光散射的干扰，Transcreener FI 测定法是专为 HTS 设计的，采用一步添加，混合和读取的测定模式。
验证要求
实现 Transcreener HTS 分析优势的一个关键因素是获取数据的酶标仪的正确设置，是否正确选择光学组件和其他参数设置会影响仪器对任何给定测定的灵敏度。通过运行 10 μM ATP / ADP 标准曲线 (24次重复 ) 来确定 Transcreener HTS 检测性能的关键仪器参数，并使用该标准曲线模拟酶促反应。从 10μM 浓度的 ATP 开始， ADP 的量慢慢增加，ATP 的量则按比例的减少，使腺嘌呤核苷酸总浓度保持在10 μM。调整积分时间来实现 Z' ＞ 0.5 的质量要求。如果 10μM ATP 在 10% 的转化率下能达到 Z' 值 ＞ 0.7，则表明该仪器能够用于 Transcreener FI 检测。
样品 FI 的标准曲线
随着 ADP:ATP 比例的增加，结合示踪剂与游离示踪剂的比例降低，从而导致 RFU值整体增加。使用 SpectraMax iD5 多功能微孔读板机读取含有 15 点标准曲线的测定板，该曲线由 ADP:ATP 的比值 所 代表的转化率，范围在 1％ 至 100％。

优势
• 一步添加，混合和读取的测定形式，非常适用于高通量筛选
• 使用 10 μM ATP 在 10% 的转化率下达到出色的数据质量 Z′＞0.7
• 三分钟或更短的时间内读完 384孔板

材料
• Transcreener® ADP2 FI (3013)
• Transcreener® GDP FI (3014)
• ATP/ADP 组合液 : 10 mM MgCl2, 20 mMHEPES, pH 7.5, 0.01% Brij-35 和 ATP/ADP ( 结合成恒定的腺嘌呤浓度 10 μM )
• ADP 检 测 混 合 液 : 1X Stop & DetectBuffer B, 8 nM ADP Alexa594 示踪剂和10 μg/mL ADP2 AntibodyIRDye®QC-1( 抗体 - 淬灭剂的耦合物 )
• 游离示踪剂 – 1X Stop & Detect Buffer B和 8 nM ADP Alexa594 示踪剂
• 缓冲空白液 – 1X Stop & Detect BufferB 和 10 μg / mLADP2 Antibody -IRDye®QC-1
方法
1. 在 384 孔板的整行中分配 10 μL 的每种 ATP / ADP 组合浓度的组合液。
2. 在这些行中加入 10 μL ADP 检测混合液。
3. 将 10 μL 的 10 μM ATP / 0 μM ADP 组合液分配到 P 行。
4. 将 10 μL 的游离示踪剂分配到 P1-P12孔中。
5. 将 10 μL 缓冲液空白液分配到孔P13-P24 中
有关如何制备标准曲线的详细步骤，请参 阅 相 应 的 Transcreener  技术手册 ( https : // www . bellbrooklabs .
com/technical-resources/technicalmanuals/)
微孔板读板机
• SpectraMax iD3 多功能读板机
• SpectraMax iD5 多功能读板机
SpectraMax iD5 可选择配件：
• 565 nm 带宽 30 nm 的荧光滤光片(Molecular Devices cat. #6590-0131)；
• 625 nm 带宽 35 nm 的荧光滤光片(Molecular Devices cat. #6590-0108)
使用 SpectraMax iD5 酶标仪的四光栅系统进行波长选择的荧光检测与使用专门用于 Alexa594 示踪剂的滤光片对的荧光检测行了比 较，SpectraMax iD3 酶标仪仅使用四光栅系统检测荧光。

仪器设置
SpectraMax iD3/ iD5 酶标仪配 合SoftMaxPro 数据采集和分析软件，按照下面的步骤，使用优化的设置读取微孔板：
1. 打开 SoftMax Pro 软件，“ 读取模式 ”选择“FI”，“ 读取类型 ”选择“Endpoint”。
2. 在“ 波长 ”选 项分别输入激发波长为575 nm，发射波长为 620 nm。如果使用滤光片 ( 仅在 SpectraMax iD5 酶 标仪上提供 )，请安装 565/30 激发滤光片和 625/35 发射滤光片，然 后从激发和发射波长的下拉菜单中选择这个滤光片对。
3. 根据要检测的微孔板选择微孔板的“ 类型 ”，待测的微孔板区域选择“ 读数区域 ”。
4. 将“ PMT 增 益 ”设 置为“ 自动 ”，仪器默认是顶部读取 ( 请勿选中“ 从底部读取 ”框 )
5. 如果使用光栅系统， 则将积分时间设置 为 50-200 ms ( 增加积分时间可提高 10% 转化的 Z ′ 值 )； 如果使用SpectraMax iD5 读板机的滤光片对，则设置为 50 ms。
6. 最初进行测定时，应始终优化微孔板和读数高度。只要体积，微孔板类型，示踪剂和浓度保持不变，相同的仪器设置可用于读取后续板。 表 1 总结了上述设置。
结论
在本文中，我们验证了使用 SpectraMax iD3和 iD5 多功能读板机进行 Transcreener FI测定法的优越性能，使用应用程序说明中建议的仪器参数优化了设置，可以实现出色的数据质量 Z′ > 0.7