使用 SpectraMax 微孔板读板机进行 HTRF IP-One Gq 检测

简介
HTRF 是 Cisbio 公司开发 的用于检 测 生物 分子相互作用的实验技术 1。它将荧光共振能量转移 (FRET) 技术与时间分辨(TR) 荧光技术相结合，可以消除荧光寿命较短的背景荧光。该检测方法使用铕 (Eu3+) 或 铽 (Lumi4 ™ -Tb) 的穴状化合物作为供体，荧光团 ( XL665 或小分子 d2 ) 作为受体。当供体和受体距离足够近时，供体被一个能量源激发，可以引发能量转移到受体，使其在特定波长发出荧光。
在这里， 我们展示了如何使 用 SpectraMax i3x 和SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机应用 HTRF 技术进行Gq- 偶联受体的分析。G 蛋白偶联受体的分析主要通过检测cAMP 和 IP3 这两条信号转导通路调控介导的细胞内钙离子水平的升高。Cisbio 公司的 IP-One Gq 试剂盒通过检测 IP3 的稳定下游代谢产物——磷酸肌醇 (IP1) 的积累，为钙离子检测提供了一种替代方法 ( 图 1 )。

在氯化锂 (LiCl) 存在的情况下，IP1 的降解被抑制并在信号细胞中积累 ( 图 1 )。在 IP-One HTRF 实验中，带有 d2 受体的IP1 可以与细 胞 产生的天 然 IP1 竞争，结合带有穴状化合物供体的 IP1 特异性单克隆抗体。细胞产生的未标记 IP1 ( 天然 IP1 ) 的增加会导致 TR-FRET 的中断和 HTRF 信号强度的减弱( 图 2 )2。IP-One 检测可用于表征贴壁细胞或悬浮细胞中作用于 Gq- 偶联受体的化合物。

优势
• 经 HTRF 认证确保仪器性能
• 高灵敏度和宽动态范围
• 分析功能强大，适用于高通量分析 (HTS) 平台

实验材料
• IP-One Gq 试剂盒 , 1000 次 (Cisbio cat. #62IPAPEB)
• 白色 384 孔微孔板 (Greiner cat. #784075)
• SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机 (Molecular Devices cat. #I3X)
• HTRF 检测卡盒 (Molecular Devices cat. #0200-7011)
• SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机 (Molecular Devices cat. #ID5)
• HTRF 检测系统 ( Molecular Devices cat. #6590-0144; 包含增强型 TRF 模块 , 激发和发射滤片 )

方法
如产品使用说明书所示 3，IP1 标准品制备的最终浓度范围为 1.9nM 至 7700 nM。包括一个没有任何未标记 IP1( 最大 FRET ) 的阳性对照和一个没有 IP1 或抗 IP1-d2 抗体的阴性对照。如图 3所示，试剂的最终用量为每孔 20 µL。将微孔板在室温下孵育 1小时，使用 SpectraMax i3x 和 iD5 读板机读取数据，优化设置如表 1 所示。
调整延 迟时间，间隔时间和脉冲次数以优化设置，直到△ F％ ( 请参见下面的数据分析 ) 显著增加。 并且可以将表 1 中列出的优化设置应用到同一型号的任何酶标仪上，即下面列出的 SpectraMax iD5 微孔板读板机的设置可以用于任何一台SpectraMax iD5 读板机。但是，当使用新类型的微孔板 ( 或大量微孔板 ) 或试剂体积发生改变时，都应执行微孔板优化和读数高度调整，以使读板机的光学系统对准化验板。 这样可以确保最小的误差，以及最佳的检测灵敏度和动态范围。

数据分析
HTRF 分析使用 Cisbio 公司的专利比值测定法，该方法基于检测到的两个发射波长。将供体在 616 nm 处的发射作为内参，受体在 665 nm 处的发射作为被测生物反应的指示。这种比值测定方法可以减少孔间误差并消除复合干扰。在下面第 4 步中计算的 △ F 反映了分析背景的信号，适用于批间分析的比较。根据 665 nm/616 nm 比值计算得到的结果用 △ F 表示如下 :

使用 SoftMax Pro 软件生成和分析数据，该软件包含预先配置的 HTRF 协议，可以简化使用上述方法进行检测和分析的流程。
结果
在 SpectraMax i3x 和 SpectraMax iD5 微孔板读板机上使用SoftMax Pro 软件绘制标准曲线，并进行 4 参数曲线拟合 ( 图4)，结果见表 2。使用 EC50 评估该测定方法的适用性，EC50 值应低于 150 nM。对于两个读板机，EC50 值均低于 85 nM，处于可接受范围内。Cisbio 将可接受的信噪比定义为≥ 20，两个读板机都满足这个标准。凭借这些结果以及所有标准的 CV值均低于 6 ％， 这些实验结果表明利用 SpectraMax i3x 和SpectraMax iD5 读板机进行 IP-One 检测具有高灵敏度和宽动态范围。

结论
SpectraMax i3x 和 iD5 微孔板读板机分别配备 HTRF 认证的检测卡盒或 HTRF 认证的检测系统。根据 Cisbio 的认证标准，两个读板机都具备检测 IP1 浓度的能力。使用预置 HTRF 协议的 SoftMax Pro 软件可以简化数据采集和分析流程。