融合标签表达系统纯化无标签的重组蛋白

采用ProfinityeXactTM

亲和标签已成为后基因组学时代纯化重组蛋白常用手段。此方法无需了解蛋白质的生化特性或生理活性，就可通过带标签的重组融合蛋白选择性地与层析基质上的配体结合，从而得以纯化任何蛋白质。此方法与常规的层析方法不同之处在于，针对不同的蛋白质需要开发特定的配体和方法。采用保护蛋白质结构和功能完整性的温和条件，已成功地通过一步亲和层析从粗提物中纯化出了多种重组蛋白，纯度达90％以上。（Arnauetal.2006）。

然而，对于蛋白质的结构研究和ZL或诊断试剂的应用，我们期望获得天然的无标签蛋白，以避免亲和标签所带来的潜在干扰（Arnauetal.2006,Bucheretal.2002）。因此需要用蛋白酶剪切纯化的融合蛋白，然后再经亲和层析去除蛋白酶和切除的融合标签从而获得天然纯品。然而针对某些特定的融合蛋白，此剪切过程比较困难。另一体系采用内含肽对融合蛋白进行自我剪切从而获得天然N端的重组蛋白。然而，这一自我剪切过程很缓慢并大大依赖于内含肽与目的蛋白连接处的氨基酸序列（Waugh2005），因此限制此方法应用于重组蛋白的纯化。
ProfinityeXact纯化介质是ProfinityeXact融合标签系统的一部分，该系统可在E.coli中高表达重组蛋白并对其进行纯化。它将亲和层析纯化和标签的去除整合成一步，从而解决了亲和层析纯化的重组融合蛋白到获得天然重组蛋白的技术壁垒（Ruanetal,2004）。将目的蛋白的编码序列克隆至ProfinityeXactpPAL7表达载体的ProfinityeXact标签的下游，从而产生了N端带有标签的重组蛋白（图1）。固定在ProfinityeXact纯化介质上的突变的丝氨酸蛋白酶选择性地与ProfinityeXact标签结合（Kd<100pM）(Ruanetal,2004)。通过结合后的清洗过程去除宿主细胞的杂质，然后加入F－或N3－精确地诱发了亲和标签与目的蛋白之间的酶切，从而导致ProfinityeXact标签被固定的蛋白酶滞留在介质上，仅预期的重组蛋白从层析柱上洗脱，且无需其它处理即可将其进行下游应用。

图1ProfinityeXactpPAL载体
我们利用ProfinityeXact融合标签系统纯化了多种不同分子量的蛋白，并用各种参数测试了它的性能。数据显示了该新型纯化系统的有效性，包括选择性的捕获带标签蛋白、亲和标签柱上的精确剪切，及整体有效并简便的纯化过程。对用ProfinityeXact纯化介质装填的ProfinityeXactminispin层析柱和Bio-ScaleTM层析柱进行柱性能评价，评价参数有多次纯化和再生循环后介质的稳定性及在变性剂如尿素存在时介质的功效。

结论
我们已利用ProfinityeXact融合标签系统纯化了多种无标签的重组蛋白。该系统是目前仅有的采用通常操作手段仅一步层析过程，即可获得完全去除标签的重组蛋白。通常的亲和标签纯化及去除需要条件优化，并且很费时，而利用ProfinityeXact系统制备无标签、N端无任何其它残基的重组蛋白只需大约1小时。该亲和介质较为稳定，可多次用于目的蛋白的纯化，从而节约了成本。同时，我们证实了ProfinityeXact纯化介质的结合和柱上剪切特性可在高达4M尿素的情况下得以实现。因此，该系统适用于纯化以不溶的聚集体形式存在的重组蛋白。ProfinityeXact融合标签系统的有效性和一致性将使其成为获得高产率无标签重组蛋白的通用平台。

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