铁蛋白酶联免疫检测

北京方程生物提供人铁蛋白（FE）酶联免疫分析试剂盒操作说明
本试剂盒仅供研究使用。
本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中铁蛋白（FE）含量。试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人铁蛋白（FE）水平。用纯化的人铁蛋白（FE）
抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入铁蛋白（FE），再与HRP
标记的铁蛋白（FE）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物
TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。颜
色的深浅和样品中的铁蛋白（FE）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD
值），通过标准曲线计算样品中人铁蛋白（FE）浓度。
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3YZ辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
人铁蛋白（FE）酶联免疫分析试剂盒操作步骤
1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
释。
400ng/ml5号标准品150l的原倍标准品加入150l标准品稀释液
200ng/ml4号标准品150l的5号标准品加入150l标准品稀释液
100ng/ml3号标准品150l的4号标准品加入150l标准品稀释液
50ng/ml2号标准品150l的3号标准品加入150l标准品稀释液
25ng/ml1号标准品150l的2号标准品加入150l标准品稀释液
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50l，待测样品孔中先加样品稀释液40l，
然后再加待测样品10l（样品Z终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽
量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15分钟.
10.终止：每孔加终止液50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
人铁蛋白（FE）酶联免疫分析试剂盒操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的
OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，
即为样品的实际浓度。
人铁蛋白（FE）酶联免疫分析试剂盒注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未
用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间Z好
控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，Z好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值
大于标准品孔diyi孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计
算时请Z后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月

检测步骤

ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品(这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内)。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。

检测方法

折叠双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原Z常用的方法，操作步骤如下:
双抗体夹心法
双抗体夹心法

一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体:洗涤除去未结合的抗体及杂质。

二、加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

三、加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

四、加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体Z好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。

在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应(hookeffect)，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时，应注意可测范围的Zgao值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标(参见6.2)。

双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

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