动物细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒中文版

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【导读】动物细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒产品说明书（中文版）主要用途动物细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂是一种旨在通过差速离心技术从动物细胞中分离出各种正常外向膜性囊...

动物细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

动物细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂是一种旨在通过差速离心技术从动物细胞中分离出各种正常外向膜性囊泡（Right-sideout；RSOV）和内侧外翻膜性囊泡（In-sideout；IOV）组分的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种动物、人体细胞的膜性囊泡的制备。其制备物产量高，可以被用于膜通道、信号传导机制、膜蛋白分布等研究。产品不含污染性蛋白酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度俱佳。

技术背景

膜性囊泡（membranevesicle）分成正常外向膜性囊泡（Right-sideout；RSOV）和内侧外翻膜性囊泡（In-sideout；IOV）。正常外向膜性囊泡是通过去除细胞浆内容物，使之失去细胞内在的代谢系统，同时保持质膜的原始位相，有利于提供适合的底物，不会受到降解和代谢，建立动力机制，进行转运或摄入研究，例如微粒体组分用于V型ATP酶研究、线粒体组分用于F型ATP酶研究。而内侧外翻膜性囊泡是通过裂解细胞和细胞器后，质膜重新闭合形成内侧面外翻的囊泡状结构，广泛用于原发性转运系统的研究。

产品内容

清理液（ReagentA）200毫升

平衡液（ReagentB）60毫升

保存液（ReagentC）20毫升

产品说明书1份

保存方式

保存保存液（ReagentC）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

HANK平衡盐缓冲溶液（GMS12028）或PBS缓冲溶液（GMS12033）：用于清理细胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离

完全细胞培养液（GMS12052）：用于细胞处理所需的培养基

50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

4℃超速离心机：用于分离膜性囊泡

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

实验步骤

一、正常外向膜性囊泡分离（线粒体和微粒体）

准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5X107），直至细胞生长铺满整个培养表面分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去重复实验步骤2一次加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面置入37℃培养箱3分种轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液移入一个50毫升锥形离心管放进台式离心机离心10分钟，速度为200g小心抽去上清液加入10毫升预冷的清理液（ReagentA），混匀细胞放进台式离心机离心10分钟，速度为300g小心抽去上清液加入3毫升预冷的平衡液（ReagentB）涡旋震荡5秒，充分混匀即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器在冰槽里用研磨棒匀化细胞（约80下）将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g小心移出上清液到2个新的1.5毫升离心管，同时保留沉淀颗粒加入500微升保存液（ReagentC）到沉淀颗粒管――此为线粒体RSOV组分（注意：可用于F型ATP酶研究）将含有上清液的2个1.5毫升离心管放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为100000g小心抽去上清液分别加入500微升保存液（ReagentC）――此为微粒体RSOV组分（注意：可用于V型ATP酶研究）移取10微升进行蛋白质定量测定（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）即刻放进－70℃冰箱里保存

二、内侧外翻膜性囊泡分离（质膜分离）

准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5X107），直至细胞生长铺满整个培养表面分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去重复实验步骤2一次加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面置入37℃培养箱3分种轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液移入一个50毫升锥形离心管放进台式离心机离心10分钟，速度为200g小心抽去上清液加入10毫升预冷的清理液（ReagentA），混匀细胞放进台式离心机离心10分钟，速度为300g小心抽去上清液加入3毫升预冷的平衡液（ReagentB）涡旋震荡5秒，充分混匀即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器在冰槽里用研磨棒匀化细胞（约80下）将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管放进4℃台式离心机离心30分钟，速度为10000g小心抽去上清液加入500微升保存液（ReagentC）――此为质膜RSOV组分（注意：可用于P型ATP酶研究）连续－70℃至37℃冻融4次――此为质膜IOV组分移取10微升进行蛋白质定量测定（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）即刻放进－70℃冰箱里保存（选择步骤）进行IOV组分纯化（建议使用IOV膜性囊泡高质纯化试剂盒－GMS10170）

注意事项

本产品为20次（5X107动物细胞）操作所有操作均须在4℃或以下状态进行建议使用足够的样品量通常5X107动物细胞的微粒体组分含量为50毫克蛋白，线粒体组分含量5毫克蛋白，100毫克质膜5．质膜IOV组分为粗提分离产物，其中含有RSOV和未予闭合的质膜不等，如果需要获得95％以上的高纯度的IOV，建议使用IOV膜性囊泡高质纯化试剂盒－GMS10170

6．纯化的样品避免反复冻融

本公司提供系列离子膜通道转运功能（transport/uptake）分析试剂产品

质量标准

本产品经鉴定性能稳定本产品经鉴定分离组分维持正常活性本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶

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2004-10-03 09:23:05

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