质粒DNA的大量提取、纯化及棉花的遗传转化

实验试剂
1.STE[0.1mol/LNaCI、10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)]
2.溶液I[50mmol/L蔗糖、25mmol/LTris-HCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)]
3.溶液II(0.4mol/LNaOH和2%SDS等量混匀)
4.溶液III(3mol/LKac,pH4.8)
5.异丙醇
6.4mol/LLiCI
7.RNase
8.苯酚、酚-氯仿、氯仿
9.乙醇
实验设备
1.摇床
2.制冰机
3.高速离心机
4.水浴锅
5.超净工作台
6.玻璃毛细管
7.微量注射器
实验材料
棉花，转化农杆菌菌株
实验步骤
1.37℃,250rpm摇菌500ml。
2.5000×g离心5min以收集菌体，用50mlSTE洗涤菌体一次。
3.加入溶液I20ml悬浮菌体。
4.加溶液II40ml，轻轻将离心管颠倒几次，置冰浴20min。
5.加预冷的溶液III30ml，将离心管颠倒几次，置冰浴10min以上。
6.10000×g离心15mm，取上清液加入0.6倍体积的的异丙醇，充分混匀后室温放置10min以上。
7.10000×g离心10min，弃上清。待沉淀干燥后用350ul水溶解，加350ul4mol/LLiCI，混匀后室温放置10min以上。
8.10000×g离心5min，取上清液加入RNase至终浓度为100ug/ml，37℃保温2h。
9.用苯酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次。上清加0.1倍体积的3mol/LNaAc(pH5.2)及2倍体积的无水乙醇。
10.离心收集DNA沉淀，70%乙醇洗涤一次。干燥后溶于TE中备用。
11.棉花的遗传转化:大量的质粒，用无菌水稀释成2mg/ml的DNA溶液进行子房注射。注射在超净工作台上进行，注射针是玻璃毛细管，顶端直径约为0.1mm。将毛细管另一端紧紧套入10-20ul的微量注射器针头，吸取被注射的DNA样品6-12ul。注射时，将针头对准子房伸出的花丝部分进行。每个子房约注射0.2ulDNA。

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