敢梦成真

关注领域：光谱仪、色谱仪

最新更新：2021-07-19 13:23:06

@向TA投稿

细胞培养基本要点

来源：内容来源于网络浏览量：1728次

【导读】（一）准备和安装过滤器　（二）合成培养基的配制　（三）小牛血清的处理　（四）生长培养基的配制（五）冻存细胞的复苏　　（六）传代　　　　　　　（七）冻存　　　　　　（八）注意事项（一...

（一）准备和安装过滤器　（二）合成培养基的配制　（三）小牛血清的处理　（四）生长培养基的配制

（五）冻存细胞的复苏　　（六）传代　　　　　　　（七）冻存　　　　　　（八）注意事项

（一）准备和安装过滤器

　　清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20min进行高压灭菌处理。在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待CJ的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。

（二）合成培养基的配制

　　1、根据细胞目录中的说明，按下表选择合适品牌及货号的培养基干粉，用适量超纯水充分溶解。

培养基品牌货号

D-MEM/F-12GIBCO12400024

Dulbecco'sModifiedEagleMedium（D-MEM）,powder（highglucose）GIBCO12800017

F-12NutrientMixture（Ham）powderGIBCO21700075

Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium（IMDM）powderGIBCO12200036

Leibovitz'sL-15MediumpowderGIBCO41300039

McCOY'sSIGMAM4892

MinimumEssentialMedium（MEM）AlphaMediumpowder（MEMα）

withribonucleosidesanddeoxyribonucleosidesGIBCO11900024

MinimumEssentialMedium（MEM）AlphaMediumpowder（MEMα）

withoutribonucleosidesanddeoxyribonucleosidesGIBCO12000022

MinimumEssentialMedium（MEM）powderGIBCO41500034

NUTRIENTMIXTUREF12HAMKAIGHN'S

MODIFICATION（F12K）SIGMAN3520

RPMIMedium1640GIBCO31800022

EGFSIGMAE9644

SodiumpyruvateSIGMAP2256-25G

MEDIUM199,WITHEARLE'SSALTSANDL-GLUTAMINE,WITHOUTSODIUMBICARBONATE.CELLCULTURETESTEDSIGMAM5017

　　2、按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。

　　3、调pH至7.2左右。

　　4、加水至Z终体积。

　　5、在超净台中对溶液进行滤过CJ，分装入250mL或500mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。

　　6、瓶口封好，4℃冰箱贮存。

（三）小牛血清的处理

　　市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体（近来也有观点认为热灭活处理是不必要的）。胎牛血清不必灭活。

　　1、将血清加热至56℃并保持30min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。

　　2、处理后的血清贮存于4℃。

　　3、小牛血清在使用前Z好进行筛选以掌握血清的质量。

（四）生长培养基的配制

　　除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和KJ素。

培养基分装成小瓶（100～200mL）以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。

按如下比例配制：基本培养基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。按1％体积分数加入双抗贮存液（青霉素+链霉素），使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U／mL和100μ／mL，。

（五）冻存细胞的复苏

应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至37-37。5度，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化。

在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞，置培养并内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养。

（六）传代:

贴壁细胞:

对于贴壁细胞应先吸（倒）尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱（或PBS洗1－3次）。50ml培养瓶加入消化液约1-3ml，按此比例进行消化，（根据经验），晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。

悬浮细胞:

一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心1000rpm，5min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。

（七）冻存

　　将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。

（八）注意事项

玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1）高压蒸汽灭菌15分钟以上;2）干烤消毒140度2小时以上;

无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上;

培养基（pH7.2）和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存;

消化液（pH7.8）或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤CJ，分装成支置-20度保存;

培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌）。至少每月一次。

进入操作时应注意先清洗双手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，如果数量较多，培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔一定的距离，开瓶（盖）时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，打开后应用灯先烧口，然后烧盖。用完后同样操作。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。

仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。

2004-11-09 09:23:09

标签：

收藏(0) 赞(0) 踩(0)

随时了解更多仪器资讯，求购、招标、中标信息实时更新，厂商招商信息随时看。大量、齐全、专业的仪器信息尽在仪器网（yiqi.com）。扫一扫关注仪器网官方微信，随时随地查看仪器用户采购、招标需求！

您可能感兴趣

细胞培养基本要点：2004-09-11 09:23:05

（一）准备和安装过滤器　　清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20mi
细胞培养基本知识2004-08-16 09:23:04

一.细胞培养的基本概念体外培养（invitroculture）包括所有结构层次的培养，即：组织培养（tiss
VMRC-RCW细胞 细胞培养基本条件栩冉生物2004-09-27 09:23:07

1，合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生
干细胞培养基本方法2004-10-12 09:23:03

MEFP0细胞培养Protocol复苏：将MEFP0细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取
人多发性瘤细胞培养总结2004-09-27 09:23:05

1、什么是细胞培养培养的细胞由于细胞增殖，数量增加，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，将培养的细胞分散
动物细胞培养基本技术指南缩写词解释2004-12-03 09:23:15

缩写词英文全称对应中文名ATCCAmericanTypeCultureCollection美国模式培养物收集
细胞培养室的卫生如何清洁？2004-07-09 09:55:17

细胞培养室卫生清理：1、培养室要制定合理的卫生制度安排，一般每周打扫次，打扫范围包括：特殊角落仪器设备阻挡处
细胞培养箱的清洁2004-07-09 09:55:17

细胞培养是以一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞的一个过程，整个过程对培养环境的要
细胞培养知识（二）2004-07-09 09:55:17

无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminar flow）以紫外灯照射30-60
细胞培养新宠CELLine 生物反应器狂热来袭2004-07-10 09:35:13

Wheaton 的CELLine 生物反应器采用细胞室与培养基室半透膜分离培养技术，突破了传统细胞培养的空

版权与免责声明

①本文由仪器网入驻的作者或注册的会员撰写并发布，观点仅代表作者本人，不代表仪器网立场。若内容侵犯到您的合法权益，请及时告诉,我们立即通知作者，并马上删除。

②凡本网注明"来源：仪器网"的所有作品，版权均属于仪器网，转载时须经本网同意，并请注明仪器网(www.yiqi.com)。

③本网转载并注明来源的作品，目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性，不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时，必须保留本网注明的作品来源，并自负版权等法律责任。

④若本站内容侵犯到您的合法权益，请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱：hezou_yiqi