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关键词:酵母双(单)杂交cDNA文库构建服务|实验技术服务
简介:世界品牌酵母双(单)杂交cDNA文库构建服务|实验技术服务原装,质量保证,价格优惠。
酵母双(单)杂交cDNA文库构建服务|实验技术服务pCzn1质粒+ArcticExpress宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信,我们提供原始的表达菌株和克隆质粒,客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
产品品牌:酵母双(单)杂交cDNA文库构建服务|实验技术服务http://www.shi极china。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
测序实验流程:
原理
酵母双杂交技术产生以来,它主要应用在以下几方面:(1)检验一对功能已知蛋白间的相互作用。(2)研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库,以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能,即以功能未知的新基因去筛选文库。
ProQuest系统依靠报告基因的转录激活来鉴定蛋白相互作用。将一个基因克隆到'诱饵'载体,pDEST32,并和GAL4蛋白的DNA结合域(DBD)表达为融合蛋白。将第二个基因或者编码可能的相互作用子蛋白的cDNA文库克隆到'猎物'载体,pDEST22,同GAL4的转录激活域(AD)表达为融合蛋白。当两个蛋白相互作用时,AD和DBD间距离被拉近,从而激活报告基因的表达
服务流程
1)提取总RNA,分离mRNA,反转录cDNA。
2)将cDNA与pDONR222载体进行BP重组反应,重组产物转化DH10B感受态细胞。
3)甘油保存大肠杆菌文库。
4)提取大肠杆菌文库质粒DNA,制备酵母感受态细胞
5)大肠杆菌文库质粒DNA转化酵母菌,测定转化效率,
6)收集酵母转化子,测定文库效价。
7)甘油保存酵母菌文库。
使用优点:在拥有相关组织基因文库的情况下
1)可以用来比对病变组织更快的找到突变基因或者导致变异的蛋白,更快的找到攻克方向。
2)可以用作大规模的蛋白筛选,在较短时间内对找到某些药物对相关组织主要的作用蛋白,对于药物的修饰和改进明确方向。
3)可以反复使用,培养时间短,适合大规模筛选使用。
4)作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
5)检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
注意事项
1.RNA的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定)。
2.要构建一个高质量的cDNA文库,获得高质量的mRNA是至关重要的,所以处理mRNA样品时必须仔细小心。
3.由于RNA酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。
4.文库构建要选择合适的载体,常规用的是λ噬菌体,这是因为λDNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源DNA。
5.胶回收前电泳槽,电泳板,梳子等都要用1%的HCl浸泡。
6.胶回收时电压要稳定。
cDNA构建成功关键因素
1.保证获得数量足够的高质量的起始RNA
2.反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键
3.层析柱cDNA分级很关键仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
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- 2004-11-23 09:23:21
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