ELISA试剂盒实验操作说明书【大鼠（Rat）胰岛素自身抗体（IAA）】

大鼠（Rat）胰岛素自身抗体（IAA）ELISA试剂盒实验操作说明书
检测原理
试剂盒采用双抗一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先
包被胰岛素自身抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP
标记的检测抗原，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过
氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。
颜色的深浅和样品中的胰岛素自身抗体（IAA）呈正相关。用酶标仪
在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞
刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地
分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟
取上清。
5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于
-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
1.酶标仪（450nm）
2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒温箱
操作注意事项
1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的
浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解
后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白，按照说明
书操作时样本已经稀释5倍，Z终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
名称96孔配置48孔配置备注
微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无
标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无
样本稀释液6mL3mL无
检测抗原-HRP10mL5mL无
20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释
底物A6mL3mL无
底物B6mL3mL无
终止液6mL3mL无
封板膜2张2张无
说明书1份1份无
自封袋1个1个无
注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、12.5、25、50、100、200μU/ml
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓
冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法
1.手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽
孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
2.自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封
袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.待测样本孔先加样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释
5倍）；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶
（HRP）标记的检测抗原100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴
锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去
洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的
OD值。
结果判断
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应
OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样
本浓度值。
试剂盒性能
1.准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于
0.9900。
2.灵敏度：Zdi检测浓度小于1.0μU/ml。
3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性：板内、板间变异系数均小于15%。
5.贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.有效期：6个月
免责声明
1.试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所
产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2.严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者
承担。
FORFORRESEARCHUSEONLY.
NOTFORUSEINDIAGNOSTICPROCEDURES.
Ratinsulinautoantibodies（IAA）ELISAKit
instruction
Intendeduse
ThisIAAELISAkitisintendedLaboratoryforResearchuseonlyandisnotforuse
indiagnosticortherapeuticprocedures.TheStopSolutionchangesthecolorfrom
bluetoyellowandtheintensityofthecolorismeasuredat450nmusinga
spectrophotometer.InordertomeasuretheconcentrationofIAAinthesample,this
IAAELISAKitincludesasetofcalibrationstandards.Thecalibrationstandards
areassayedatthesametimeasthesamplesandallowtheoperatortoproducea
standardcurveofOpticalDensityversusIAAconcentration.Theconcentrationof
IAAinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothe
standardcurve.
Samplecollectionandstorages
Serum-Useaserumseparatortubeandallowsamplestoclotfor30minutes
beforecentrifugationfor10minutesatapproximately3000×g.Removeserumand
assayimmediatelyoraliquotandstoresamplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeated
freeze-thawcycles
Plasma-CollectplasmausingEDTAorheparinasananticoagulant.Centrifuge
samplesfor30minutesat3000×gat2-8℃within30minutesofcollection.Store
samplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Cellculturesupernatesandotherbiologicalfluids-Removeparticulates
bycentrifugationandassayimmediatelyoraliquotandstoresamplesat-20℃or
-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Note:Thesamples首lebecentrifugateddequatelyandnohemolysisor
granulewasallowed.
Materialsrequiredbutnotsupplied
1.Standardmicroplatereader（450nm）
2.PrecisionpipettesandDisposablepipettetips.
3.37℃incubator
Precautions
1.Donotsubstitutereagentsfromonekittoanother.Standard,conjugateand
microplatesarematchedforoptimalperformance.Useonlythereagentssuppliedby
manufacturer.
2.Donotremovemicroplatefromthestoragebaguntilneeded.Unusedstrips
首ldbestoredat2-8°Cintheirpouchwiththedesiccantprovided.
3.Mixallreagentsbeforeusing.
Removeallkitreagentsfromrefrigeratorandallowthemtoreachroomtemperature
（20-25°C）
Materialssupplied
Name96determinations48determinations
Microelisastripplate12*8strips12*4strips
Standard0.3ml*6tubes0.3ml*6tubes
SampleDiluent6.0ml3.0ml
HRP-Conjugatereagent10.0ml5.0ml
20XWashsolution25ml15ml
ChromogenSolutionA6.0ml3.0ml
ChromogenSolutionB6.0ml3.0ml
StopSolution6.0ml3.0ml
Closureplatemembrane22
Usermanual11
Sealedbags11
Note:Standard（S0→S5）concentrationwasfollowedby:0,12.5,25,50,100,200
μU/ml
Reagentpreparation
20×washsolution:DilutewithDistilledordeionizedwater1:20.
Assayprocedure
1.Prepareallreagentsbeforestartingassayprocedure.Itisrecommendedthat
allStandardsandSamplesbeaddedinduplicatetotheMicroelisaStripplate.
2.Addstandard:SetStandardwells,testingsamplewells.Addstandard50μlto
standardwell.
3.AddSample:Addtestingsample10μlthenadd40μlofSampleDiluentto
testingsamplewell;Blankwelldoesn’taddanyting.
4.Add100μlofHRP-conjugatereagenttoeachwell,coverwithanadhesivestrip
andincubatefor60minutesat37°C.
5.Aspirateeachwellandwash,repeatingtheprocessfourtimesforatotaloffive
washes.Washbyfil领eachwellwithWashSolution（400μl）usingasquirtbottle,
manifolddispenserorautowasher.Completeremovalofliquidateachstepis
essentialtogoodperformance.Afterthelastwash,removeanyremainingWash
Solutionbyaspiratingordecanting.Inverttheplateandblotitagainstcleanpaper
towels.
6.AddchromogensolutionA50μlandchromogensolutionB50μltoeachwell.
Gentlymixandincubatefor15minutesat37°C.Protectfromlight.
7.Add50μlStopSolutiontoeachwell.Thecolorinthewells首ldchange
frombluetoyellow.Ifthecolorinthewellsisgreenorthecolorchangedoesnot
appearuniform,gentlytaptheplatetoensurethoroughmixing.
8.ReadtheOpticalDensity（O.D.）at450nmusingamicrotiterplatereader
within15minutes.
Calculationofresults
1.Thisstandardcurveisusedtodeterminetheamountinanunknownsample.
ThestandardcurveisgeneratedbyplottingtheaverageO.D.（450nm）
obtainedforeachofthesixstandardconcentrationsonthevertical（Y）axis
versusthecorrespondingconcentrationonthehorizontal（X）axis.
2.First,calculatethemeanO.D.valueforeachstandardandsample.AllO.D.
values,aresubtractedbythemeanvalueofthezerostandardbeforeresult
interpretation.Constructthestandardcurveusinggraphpaperorstatistical
software.
3.Todeterminetheamountineachsample,firstlocatetheO.D.valueonthe
Y-axisandextendahorizontallinetothestandardcurve.Atthepointof
intersection,drawaverticallinetotheX-axisandreadthecorresponding
concentration.
4.Anyvariationinoperator,pipettingandwashingtechnique,incubationtimeor
temperature,andkitagecancausevariationinresult.Eachuser首ldobtain
theirownstandardcurve.
5.Thesensitivitybythisassayis1.0μU/ml
6.Standardcurve
Storage：2-8℃.
validity：sixmonths.
FORRESEARCHUSEONLY;NOTFORTHERAPEUTICOR
DIAGNOSTICAPPLICATIONS!PLEASEREADTHROUGH
ENTIREPROCEDUREBEFOREBEGINNING!

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