赵旭波

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最新更新：2021-07-19 10:29:55

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【导读】? 分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。由于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量样本量很小，于是超微量分光光度计应运而生。超微量分光光度计近年来已经替换普通...

分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。由于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量样本量很小，于是超微量分光光度计应运而生。超微量分光光度计近年来已经替换普通的分光光度计成为分子生物学实验室的新宠，广泛应用于生命科学实验室蛋白质组学和基因组学等领域。

超微量分光光度计与传统分光光度计相比，前者具备的独特优点在于：

(1)所需样品体积小，仅需0.5—2μl；

(2)不需要比色皿，用移液枪直接将样品滴加到检测平台上，测量时样品自动形成液柱，检测完成后只需用干净的吸水纸将样品从检测平台上擦拭干净即可，避免了因为比色皿清洗不净带来的交叉污染；

(3)一般具有多个光程(电机控制自动选择)【BIO-DLMicroDrop基座模式下光程1.0mm、0.2mm、0.1mm 和 0.05mm自动调整】，而传统分光光度计的光程为10mm，超微量分光光度计样品无需稀释，测量范围可达到常规分光光度计的50倍【BIO-DLMicroDrop基座模式下dsDNA检测范围：2~15000ng/μl】；

(4)氙气闪光灯为灯源，代替了氘灯(紫外)和钨灯(可见)，使用寿命更长；

(5)不需要预热，可随时检测，检测时间短【BIO-DLMicroDrop＜5秒】；

(6)显示吸光度值的同时，程序直接给出浓度值(核酸、蛋白和荧光染料)；

(7)占据实验室空间体积比传统分光光度计小很多【BIO-DLMicroDrop重量：2.1kg】。

超微量分光光度计不仅涵盖了可见光分光光度计的功能而且也可以进行紫外分光光度计的应用，Z常用以下几方面：

核酸的定量

核酸的定量是超微量分光光度计使用频率Zgao的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链DNA、双链DNA，以及RNA。核酸的Zgao吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应消光因子。如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。除了核酸浓度，分光光度计显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。

UV-VIS常规可见-紫外检测

全波长超微量分光光度计可以像普通的紫外-可见分光光度计一样行使功能。如BIO-DLMicroDrop可以显示从185到910nm的光波下样品的吸光值。Z多可以同时指定检测40个波长下的吸光值并把数据显示在报告中。

蛋白质的直接定量(UV法)

这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。

比色法蛋白质定量

蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸(如酪氨酸，丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。

比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry等几种方法。

Lowry法：以Z早期的Biuret反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2+反应，产生蓝色的反应物。但是与Biuret相比，Lowry法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂;反应需要的时间较长;容易受到非蛋白物质的影响;含EDTA，Tritonx-100，ammoniasulfate等物质的蛋白不适合此种方法。

BCA(Bicinchoninineacidassay)法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu+，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

Bradford法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。其Zda的特点是，敏感度好，是Lowry和BCA两种测试方法的2倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA反应的还原剂(如DTT，巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的。Z主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。

细菌细胞密度(OD600)

实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。

超微量分光光度计使用时注意小贴士：

（1）测量前将样品中度混匀（可采用震荡器或用手指弹震管底）

（2）移液器吸头插入液面下吸取样品，可避免吸入气泡；TIP头贴着下光纤表面打出样品，且只按到移液器diyi挡尽头，第二挡不要按，可以避免吹出气泡到样品中。

（3）每次测量完毕后，用蒸馏水清洁上下光纤端面，这样可以更好地保证下一次测量的准确性（主要针对超高浓度样品，一般样品无此要求）。

（4）每次做空白检测前一定要先用水清洁上下光纤表面，可保证空白检测准确。

（5）每次测量的核酸样品量建议为1-2微升,蛋白样品建议2微升。过少可能无法形成水柱，过多可能溢出。

（6）加样后尽快测量，以防蒸发浓缩以及灰尘落入，已加样品不能多次检测，如需重测需重新滴加同一样品。

（7）仪器避免阳光直射，避免强风吹拂，以避免蒸发。

（8）连续测量一段时间后擦净样品，用水清洁上下光纤表面，然后用水或缓冲液进行重新空白后再检测。

（9）清洁光纤端面（上样基座）时必须用洁净质软的实验室用纸（擦镜纸等）进行轻轻擦拭。

（10）仪器不用时，将上臂放下，可以防止灰尘。

※超微量分光光度计新晋小生——MicroDrop简介

一机多用：既可使用超微量基座（下图上），也可使用常规比色皿（下图下），想怎么测就怎么测！

开机即用：交货后即可使用–安装时不需要进行任何调节。只需开启电源就能进行测量！

上样量少：上样范围0.5μl-2μl，节约珍贵的样本。再也不用担心样品不够用啦！

无线连接：无需数据线连接电脑，从此告别杂乱的数据连接线，仪器可自发WiFi信号。

全光谱范围：可检测185-910nm波长下样本的吸光值，检测范围广，基座模式下因为缩短了光程，检测浓度范围非常广阔，dsDNA:2-15000ng/ul，无需稀释样品，简化实验流程，减少实验误差，能够满足极大部分用户的需求。

检测快速：全波长扫描时间（185—910nm）只需5s，每个样品所需要的时间不到5秒钟，快速的检测速度为大量的样品检测节省了宝贵时间。

美观简约：自重2.1kg，便于移动，占地面积小，选配平板无线连接，平板可随测随取，节省实验台面空间。

数据存储：可自定义选择数据存储，不仅能够自动保存检测原始数据，也可导出Excel数据表，方便计算后续实验的加样量。

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2004-08-13 09:23:05

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