TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒说明书

（通用）
（BIOTIN标记POD法,适用于细胞、组织样本）
一TUNEL检测原理
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
二TUNEL试剂盒组分
组份 20assays 50assays 100assays 储存条件
EquilibrationBuffer 1.0mL 2.5mL 5.0mL -20℃
Biotin-11-dUTP 20μL 50μL 100μL -20℃
TdTEnzyme 80μL 200μL 400μL -20℃
50×ProteinaseK 40μL 100μL 200μL -20℃
Streptavidin-HRP 10μL 25μL 50μL 4℃避光
DAB 2mg 5mg 10mg -20℃
注意事项
1使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
2因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。
3为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
4TdT酶反应液Z好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
5另因DAB为固体粉末，使用前加入适量PBS溶解，配制成20×DAB（10mg/ml）后，按下述方法显色使用。
6用户自备：二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等、盖玻片、载玻片、染色缸。
三操作流程概览
 
本试剂盒特点●操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有ProteinaseK和DAB。
●高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。
●高特异性：能特异性染色凋亡细胞。
●快速操作：整体操作约需3小时。
●用途广泛：可应用于组织切片、细胞样本等。
●方便观察：使用光学显微镜观察实验结果。
●高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性
四检测样本的预处理
TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照Page9），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。
1细胞样本的准备.
 

操作注意事项：
1.为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
2.固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟～一晚，以改善细胞的渗透性。
3.使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。
4.进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。
5.固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制。
2石蜡组织切片的预处理
 

*注意事项：蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而有所不同，需要自已摸索优化上述条件，如有问题，请根椐本说明书Page9的《常见问题的原因及推荐解决方案》来调整条件。例如：如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的ProteinaseK（400μg/ml）处理5分钟。（本试剂盒的50×ProteinaseK浓度为1mg/ml）。
其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：
替代方法1:将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10min（通透液：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）
替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HClPH2，胰蛋白酶0.25%-0.5%溶于0.01NHCl）
替代方法3:将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml0.1M的柠檬酸缓冲液PH6的塑料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理5min。
3冰冻切片的预处理
 
4其它难于处理的组织切片的预处理
 
5阳性对照及阴性对照的准备
TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。
A：阳性对照样本的准备
组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，细胞样本在TritonX-100通透液处理、PBS浸洗后，再加入100μLDNaseI反应液（10U-3000UDNaseI，40mMTris-HClPH7.9,10mMNaCl,6mMMgCl2,10mMCaCl2）（用户自备）室温—37℃处理10—30min，其余步骤均相同。如有问题详见Page9.
B：阴性对照样本的准备
在Page8标记反应制备TdT酶反应液时，不添加TdT酶，其余步骤均相同。
五标记和显色反应：
 
操作注意事项：
1.进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。
2.PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应
3.在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4.TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
5.如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。
6.用甲基绿（MethylGreen）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M醋酸PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（1**%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80～90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。