EB病毒转化成淋巴细胞实验 实验材料 实验步骤

实验材料

1.感染性EB病毒通常取自绢猴细胞系B95-8的限制培养基。该细胞系源于EB病毒感染的绢猴外周淋巴细胞，产生高滴度感染病毒。

2.全血

1.混合10ml全血和10mlRPMI1640生长培养基
生长培养基
RPMI1640800ml
FBS200ml
2mmol/LL-谷氨酰胺
5μg/ml两性霉素
50μg/ml庆大霉素

2.取15ml无菌离心管，加3mlHisto-paque1077（Sigma），在其上加4ml稀释血，分离淋巴细胞。
3.室温300g离心30min，弃上层清亮血浆。
4.收集不透明的淋巴细胞层，细胞悬液倒入50ml无菌离心管。
5.20mlRPMI1640生长培养基洗2次，室温300g离心10min。
6.10ml血锋利的细胞悬于1.0ml含EB病毒的上清。含EB病毒上清来自绢猴细胞系B95-8（ATCC提供）的限制培养基，含EB病毒的B95-8限制培养基用前应过滤[(0.22μm无菌滤膜（Corning）]，避免污染绢猴细胞。
B95-8绢猴细胞产生高滴度感染性EB病毒，应在P2实验室中作为生物毒剂操作。高密度绢猴细胞不更换或补加培养液温育8天，收集上清，0.22μm无菌滤膜过滤，用于无限增殖的话，含EB病毒限制培养液4℃可贮存4-8周。
7.细胞悬液（1.0ml）放入25cm2组织培养瓶，垂直放置，37℃5%CO2孵育1~3h。
8.孵育后，加入3ml含0.2μg/ml刀豆凝集素A的RPMI1640生长培养基，水平放置，使细胞均匀分布于全生桌面。隔几天观察一次细胞生长状况，集落的形成标志着细胞已无限增殖化。
9.每周加1ml含刀豆凝集素A的新鲜RPMI1640生长培养基，不要吸出原培养基。

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