细胞计数及活力测定

一、原理

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。

利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

二、仪器、用品与试剂

0.4%w/v台盼兰trypanblue（GibcoBRL15250-061）Erythosinbluishstain

取0.1gramErythrosinbluish（SigmaE-9259）及0.05grampreservativemethylparaben（SigmaH-3647）溶于100mlCa++/Mg++freesaline血球计数盘及盖玻片（Hem℃ytometerandcoverslip）

计数器（counter）

低倍倒立显微镜

粒子计数器（Coultercounter,CoulterElectronics）

三、操作步骤

（一）细胞计数

3.1.取50ml细胞悬浮液与50mltrypanblue（orErythrosinbluish）等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

3.2.取少许混合液（约15ml）自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色（或红色-Erythrosinbluish）.

3.3.计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数（至少乘以2，因与trypanblue等体积混合），Z后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞（或计下线与左线之细胞）。

3.4.若不用血球计数盘，可用Coultercounter作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。

然后按下式计算：

细胞数/ml=4大格细胞总数x2/4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

（二）细胞活力

1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。

2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用.

范例：

T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格：55,62,49,59

死细胞数/方格：5,3,4,6

细胞总数=243

平均细胞数/方格=60.75

稀释倍数=2

细胞数/ml:60.75x104x2=1.22x106

细胞数/flask:1.22x106x10ml=12.2x106存活率：225/24392.6%

（三）MTT法测细胞相对数和相对活力

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。

l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。

2、沉淀加入0.5-1mlMTT,吹打成悬液。

3、37℃下保温2小时。

4、加入45ml酸化异丙醇（定容）。打匀。

5、1000rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。

注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞数。

附：

1、0.4%台盼兰染液配制：

台盼兰0.4克加双蒸水至100ml.Cbeqe

2、MTT配制：

MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。

3、酸化异丙醇配制：

异丙醇中加入HCl使Z终达0.04mol/L.

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