聚合酶链反应构建重组DNA

实验材料

DNA

TE无水乙醇DNA聚合酶CTP

电泳仪离心机PCR仪

1.制备模板DNA，如DNA不是经氯化铯梯度纯化的，100℃煮沸10min以灭活核酸酶。

2.制备寡核苷酸引物，若PCR产物要进行平端克隆，就应该对引物的5’端羟基进行磷酸化处理。

图一、用PCR反应引入单一的酶切微点和产生符合读码框架的融合蛋白。

3.建立标准的扩增反应，以矿物油覆盖表面，在以下条件下进行20~25轮扩增循环：94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸3min，Z后一个循环在72℃延伸10min尽可能使扩增产物完整。

图二、序贯PCR法构建重组DNA分子，引物1b与基因2同源区域；引物1c有与基因1同源区域

4.取少量反应混合物（4~8μl），用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增效果。

5.吸去矿物油上层，抽提1次除去残存的矿物油，用饱和酚抽提1次，然后用无水乙醇沉淀DNA。

图三、用反向PCR插入酶切位点

6.4℃高速离心10min，沉淀用20μlTE缓冲液溶解。

7.用玻璃珠，电冼脱或低融点胶的酚抽法进一步纯化PCR产物可去除未掺入dNTP引物、无关的PCR产物和模板DNA。

8.对于通过平端连接进行的克隆：用DNA聚合酶I（或klenow酶）修平扩增片段的3‘末端。

9.对于通过粘端连接进行的克隆：在20μl体积用合适的酶消化一半PCR只产物，用过量的酶消化数小时。

10.用合适的末端互补的酶在20μl体积内消化0.2~2μg载体DNA，用CIP去瞵酸化，以阻止载体自连。

11.用普通琼脂糖或低融点琼脂溏电泳分离线性化的载体。

12.用玻璃珠、电洗脱、或酚抽法回收线状的载体。

13.连接PCR片段和线状载体。

16.测定质粒DNA中扩增片段的序列，检查有无突变，或者用生物化学或遗传学方面的功能分祈筛选转化体。

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