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光谱技术 | 荧光测量

发布：北京爱蛙科技有限公司

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生活中荧光类物品随处可见，荧光笔、荧光粉、荧光灯... 这些日常用品在为我们带来便捷的同时也给予了我们美的享受。

还有，疫情期间的核酸检测是将2019-nCoV（属于RNA病毒）先逆转录为cDNA，再进行扩增检测，通过荧光定量PCR所得到的样本Ct值的大小，可以判断患者样本中是否含有SARS-CoV-2。

荧光的优势：

高灵敏度 — 可检测到极低的样品浓度；
定量结果 — 在大多数情况下，荧光信号与浓度成正比，并在皮秒的精度内对浓度变化作出响应；
无损测量 — 与其他一些技术的不同之处在于，荧光对液体和固体样品均无破坏性。

一、荧光

荧光是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光照射，吸收光能后进入激发态，并且立即激发并发出比入射光的波长长的出射光(通常波长在可见光波段》，很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。另外有一些物质在入射光撤去后仍能较长时间发光，这种现象称为余辉，也称为磷光。

荧光原理：光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。

波长与能量之间的关系式是E=hc/λ，式中E代表能量，h为普朗克常数;c是光在真空中的光速，λ是波长。

常见现象:入射的绿光/蓝光被吸收(强度损失)，并以不同的较长的波长(强度增益甚至新增的“颜色”)再次发射。

定性分析理论基础:不同的发光物质内部结构不同且具有不同的发光性质，所以可以根据荧光光谱的性质实现对荧光物质的鉴别。

定量分析理论基础:荧光强度与物质的浓度在一定范围内成线性关系。在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比:F=Kc。其中，F为荧光强度，c为荧光物质浓度，K为比例系数。

二、荧光测量系统搭建

荧光测量需要一个高灵敏度的探测器和滤光片，滤光片用以将样本发出的微弱信号光和高强度的激发光区分出来。接下来我们对荧光测量解决方案（激发光、比色皿支架等）进行详细分析。

1）光源：

LSM LED激发光源
LSM LED是荧光激发的理想选择，可用于265-880nm之间窄带照明和色温3000K暖白色宽带照明。LSM LED提供了一个可编程的驱动控制器，可以监控LED电源输出，温度等。根据样品特性选择合适的激发光源波长，LED激发光源窄带波长:265 nm,280 nm,310nm, 365 nm ,405 nm, 470 nm, 533 nm,635 nm, 880 nm。
HL2000光源(或HPX-2000光源，DH-2000-FHS光源)
HL-2000卤钨光源是一种多用途光源，使用范围VIS-NIR(360 nm-2400 nm)。该光源内置致冷风扇，可以保证光源的稳定性。HL-2000卤钨光源配有内嵌滤光片凹槽，凹槽的尺寸为25.4mm2或50.8 mm2，厚度为3mm。其中，HL-2000-FHSA型号有手动和TTL快门，可用来控制光源的强弱。

图1. SQ系列405nm LED激发光源

2）比色皿支架：

Square One比色皿支架
SQUARE ONE是一款坚固、易于使用的比色血支架，可用于高精度的吸光度和荧光测量。支架可容纳1cm光程长度的比色皿，具有遮光盖以减少环境光照对测量的影响，从而确保比色皿和滤光片提供的测量结果处于最佳状态。SQUARE ONE (SQ1-ALL)有一个内置的反射镜，用于优化荧光信号的强度。两个滤光片槽，可接受直径为12.5 mm或25 mm的光学滤光片，通过滤光片，用户可以调整荧光激发和发射波长，或者去除不需要的波长以减少杂散光。
QPOD可控温度比色皿支架
QPOD可控温度样品容器可将标准1平方厘米比色皿的温度控制在+/-0.05C 的范围以内，这个部件包含一个Peltier 控制器、磁搅拌器和石英聚光镜，以及用于与海洋光学光谱仪和附件连接的SMA905接头。每个部件都是可溯源到NIST温度，其数据是可信赖的。
FIA系列荧光流通池
用于荧光在线检测。抗化学腐蚀性好，光纤一端连接激发光源，并通过石英视窗到达流通池内部，另一端90°位置光纤接收发射光谱，并通过光纤到达光谱仪。

图2.Square One比色皿支架

3）比色皿：

一次性塑料比色MCVD系列
CVD系列塑料比色血是通用的，无需维护的比色皿使用与光谱应用在UV-Vis(220-900 nm和Vis-NIR(350-900 nm)区域。标准试管有1厘米(10毫米)的路径长度，但随着填充体积和窗口尺寸的变化而变化，另有2mm和4.5mm可选。
石英比色皿
Ocean insight提供多种石英比色皿，用于吸光度、透射和荧光测量。所有的比色皿都适用于170-2700nm的应用，并将安全地适合比色皿支架。可选择满足填充量要求和测量需要通过适当的护理和维护，保持没有划痕，裂缝和类似的缺陷，石英比色皿可以有效地重复使用
CFV系列荧光比色皿
FluoroVettes是对微小量样品进行荧光分析、紫外透光的一次性微型试管。FluoroVettes的容积为50微升，能透过220nm的紫外线，适用于下列应用:用吸液管装样品，与水泵相接来做流体研究。

图3. CVFL系列石英比色皿

4）滤光片：

LVF系列线性可滤光片
OceanInsight的线性可变滤波器(LVFs)是涂有干涉涂层的57mm x10mm石英基板-特别适用于从宽频光源中制造出在荧光测量中的所需要的激发光。类型:单高通、单低通滤光片，双高通、双低通滤波片，高通和低通可变带通虑光器滤光范围:300-750纳米(LVF系列)，230-500纳米(LVF-UV系列)。20F2系列滤光片
OF2系列滤光片
可轻松配置到光源，比色血支架和样品架上，以适应各种应用特点: (1)多种选件一可供选件包括高通、低通、带通和中性密度滤光片; (2) 方便-滤光片可轻松装入光谱测试系统中。尺寸: 12.7 mm OD round; 25.4 mm x 25.4 mm x 3 mm square; 50.8 mm x 50.8 mm x 3 mmsquare; 8 mm diameter x 2-2.5 mm thickness 滤光范围:190nm-1700 nm

图4. LVF滤光片

5）光谱仪：

海洋光学提供多种可用于荧光测量的光谱仪，如flame系列，Ocean HDX，QE PRO，Maya 2000 PRO，NIR Quest等，同时可配置大芯径光纤，大狭缝等进一步提高系统的灵敏度，独缝尺寸有5um，10um，20um，50um，100um，200um和无独缝设计。

紧读型Flame系列光谱仪，UV-NIR，可更换狭缝，较好的灵敏度和热稳定性，较小的台间差，适合一般荧光应用；
高通量Ocean HDX光谱仪， UV-NIR，可更换狭缝，高通量、低杂散光和高热稳定性，适合一般荧光应用；
高灵敏度QE PRO光谱仪， UV-NIR，可更换狭缝，高灵敏度，高信噪比，TEC致冷，适合弱荧光信号应用；
高灵敏度Maya 2000 PRO光谱仪: UV-NIR，可更换狭缝，高灵敏度，高信噪比，适合弱荧光信号应用；
近红外NIR Quest光谐仪: 900-2500 nm，可更换狭缝，高灵敏度，高信噪比，适合近红外荧光信号应用。

图5. Ocean 光纤光谱仪

6）软件：

OceanView是海洋光学的旗舰级光谱应用软件，支持Windows，Mac OS和Linux系统，兼容海洋光学现有所有光谱仪。内置大量应用向导，能引导客户完成复杂的光谱应用测试（吸光度、透过率、反射率、荧光、拉曼、辐射测量等）。只需选择所需的测量应用，软件会一步一步引导，让您轻松地完成系统设置和数据采集。