2020版《ZG药典》2341中药农残测定通则解决方案（甘草）

近年来，随着医药产业的快速发展和公众对药品安全认知水平的不断提升，加强对中药外源性有害物质的控制，建立有关标准已成为满足药品监管需求、保障公众用药安全的重要手段。中药材大部分来源于植物和动物，在种植（养殖）过程中不可避免地会发生病虫草害，需要使用农药进行FZ；而使用农药不意味着滥用农药，国家对于高毒、高残留、高安全风险的化学农药出台了禁用名单，需要首先加以监控。

在参考了我国农业农村部自2002年至今发布过的化学农药禁限用公告后，《ZG药典》2020年版经剔除杀鼠剂、重金属类农药、熏蒸剂、多异构体、难以获得对照品及难以采用常规气质、液质测定的农药品种后，总计 33 种农药 55 个化学单体作为禁用农药检测品种的检测指标。

本文参考2020版《ZG药典》2341 通则中的第五法使用LabTech SPE 1000全自动固相萃取系统对常用根茎类药材甘草中的农药进行固相萃取，分别采用GC-MS、LC-MS检测，建立了一套中药农残的处理检测方法，其中GC-MS组分别采用GCB/NH2柱净化与HLB柱净化样品，两种方法的回收率及平行性良好，加标回收率分别为71.1%~101.2%和73.3%~106.7%，重复性RSD分别为1.2%~8.6%和1.3%~9.0%，LC-MS组采用HLB柱净化样品，加标回收率为74.8%~113.4%，重复性RSD为2.3%~9.8%，均满足药典要求，适合2341第五法通则所规定中药农残检测。

1 仪器设备及试剂

1.1 仪器设备

SPE 1000全自动固相萃取系统（莱伯泰科公司）；7890B-5977B气相色谱质谱联用仪（安捷伦公司）；SCIEX Exion LC™液相系统+ Triple Quad™ 4500质谱系统（SCIEXZG公司）；MultiVap-10全自动高通量平行浓缩仪（莱伯泰科公司）；EV400VAC旋转蒸发仪（莱伯泰科公司）。

1.2 试剂及耗材

乙腈（色谱级）；甲苯（农残级）；乙腈-甲苯混合溶液（3∶1），现用现配；氯化钠（分析纯）；蒸馏水；HLB固相萃取住（200mg，6mL，莱伯泰科）；GCB/NH2固相萃取柱（500mg/500mg，6mL，莱伯泰科）33种农残混标工作液：5μg/L，溶剂为乙腈，购自坛墨质检；磷酸三苯酯内标工作液：0.1mg/L，溶剂为乙腈，购自坛墨质检；30种农残混标工作液：5μg/L，溶剂为乙腈，购自坛墨质检。

2 实验方法

2.1 样品处理

称取甘草粉末（过3号筛）5g，加氯化钠1g，摇散后加入乙腈50mL，匀浆处理2min（每分钟不低于12000转），离心5min（每分钟4000转），取上清液，沉淀再加入50mL乙腈匀浆，离心，合并两次上清液，旋蒸浓缩至3~5mL后，用乙腈定容至10mL。

2.2 GCB/NH2柱固相萃取法

将2.1制得的样品各取2mL放入SPE 1000全自动固相萃取系统，按照图1所示的方法进行样品的固相萃取净化步骤。

收集洗脱液，旋蒸浓缩，用乙腈转移并定容至2mL。

图1 GCB/NH2柱固相萃取流程

2.3 HLB柱固相萃取法

将2.1样品各取3mL放入SPE1000全自动固相萃取系统，按照图2所示的方法进行样品的固相萃取净化步骤，收集净化液。

图2 HLB柱固相萃取流程

2.4 基质加标回收率实验

基质标准曲线的配制：分别按照2.2、2.3制备空白基质溶液，各取1mL（每种方法所得样品平行6份）至MultiVap-10全自动高通量平行浓缩仪上，40℃浓缩至约0.6mL，分别加入10μL、20μL、50μL、100μL、150μL、200μL混标工作液，加乙腈定容至1mL，混匀。

按2.1方法准备样品，进行加标实验，5g样品加标1μg，然后分别按照2.2、2.3方法进行实验，同时进行6个平行样品，用来测定加标回收率及平行性。

取处理好的样品溶液（或基质混标溶液）1mL，GC-MS法精密加入内标0.3mL，LC-MS法精密加入水0.3mL，混匀待测。

2.5 GC-MS分析条件

2.5.1 气相色谱条件

色谱柱：Agilent DB-5ms毛细管柱：30 m*250 μm*0.25μm；

进样口温度：270℃；

柱温程序：初始温度100℃，以5℃/min升至180℃，保持5min，然后以5℃/min升至220℃保持6min，再以10℃/min升至280℃，保持5min。

进样量：1 μL；

进样方式：不分流进样；

流速：1.0mL/min；

2.5.2 质谱条件

离子源温度：280℃；

辅助加热温度：290℃；

溶剂延迟：3min；

扫描方式：全扫描（SCAN）方式用于定性/选择离子扫描模式（SIM）用于定量。

2.6  LC-MS分析条件

2.6.1 液相色谱条件

色谱柱：Shim-pack Velox C18（2.7μm，2.1*100mm）；

流动相：A: 0.1％甲酸溶液（含5 mmol/L 乙酸铵）；B:乙腈-0.1％甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵）（95:5）；

流速：0.4 mL/ min；柱温：40℃；进样量：2 μL；

洗脱梯度：0~1min，30%B；7min~8min，100%B；8.1~10min，30%B。

2.6.2 质谱条件

离子源：ESI源，正离子模式；

离子源参数：

IS电压：5500V 气帘气CUR:30 psi；

雾化气GS1:55 psi 辅助气GS2:55 psi；

源温度TEM:550℃碰撞气CAD:Medium。

3 结果和讨论

3.1 各样品色谱图

图3 标准工作液GC-MS总离子流色谱

图4 空白样品GC-MS总离子流色谱图

图5 基质加标GC-MS总离子流色谱图

图6 标准工作液GC-MS选择离子流色谱图

图7 基质加标GC-MS选择离子流色谱图

图8 标准工作液LC-MS总离子流色谱图

图9 基质加标LC-MS总离子流色谱图

3.2 标准曲线

按2.4中的配制的基质混标溶液（0.05μg/mL~1μg/mL）计算得出各组分（以相对峰面积和相对浓度作标准曲线) 的线性方程、相关系数，见表1、2、3。

表1  33种农残GC-MS法线性方程（GCB/NH2柱固相萃取法）

表2 33种农残GC-MS法线性方程（HLB柱固相萃取法）

表3  30种农残LC-MS法线性方程（HLB柱固相萃取法）

3.3 加标回收率

加标样品经固相萃取净化、洗脱、浓缩后，分别进行GC-MS、LC-MS分析，定量，计算得到的加标回收率及相对标准偏差如表4、5、6所示。

表4 33种农残GC-MS法加标回收率（GCB/NH2柱固相萃取法）

表5  33种农残GC-MS法加标回收率（HLB柱固相萃取法）

表6  30种农残LC-MS法加标回收率（HLB柱固相萃取法）

4 实验结论

由表4、5、6可知，2020版《ZG药典》2341第五法GC-MS组中GCB/NH2柱固相萃取和HLB柱固相萃取的加标回收率分别为71.1%~101.2%和73.3%~106.7%，重复性RSD分别为1.2%~8.6%和1.3%~9.0%，LC-MS组HLB柱固相萃取的加标回收率为74.8%~113.4%，重复性RSD为2.3%~9.8%，均满足药典要求。

综上所述，莱伯泰科SPE1000全自动固相萃取系统、EV400VAC旋转蒸发仪及MultiVap-10全自动高通量平行浓缩仪能够gao效、稳定地达到实验的要求，适用于2020版《ZG药典》2341第五法中规定的中药农残测定，适用于中药甘草样品的前处理实验。

5 参考文献

[1] 中华人民共和国药典2020年版. 四部［S］.2020: 30ChP 2020. VolⅣ［S］. 2020: 30.

[2] 申明睿,翟为民,何轶,石上梅,杨昭鹏,兰奋.《中华人民共和国药典》2020年版中药禁用农药残留限量标准的研究思路[J].药物分析杂志,2020,40(11):2075-2081.