天美讲堂丨小针孔•大用途——针孔技术助力共聚焦显微拉曼分析

小针孔·大用途

针孔是共聚焦显微拉曼的主要特征，与传统光学显微拉曼相比，在空间分辨率和成像对比度方面具有突出优势。

为什么针孔结构是必须的？

当激光通过拉曼显微镜聚焦到样品中时，样品内部形成一个三维激发体。这个体积被称为激发点扩展函数(PSF)。当光汇聚到焦点处时，PSF的直径减小，在焦点面上达到衍射极限的最小直径，然后随着光的发散而增大直径。PSF的真实形状依赖于样品的光学特性，如对激发波长的透过率、折射率以及它如何散射入射的激发光。拉曼散射将发生在整个激发体中，仅仅从激发体测量拉曼光谱，会得到整个三维激发体的图谱，但Z轴方向的信号会被削弱。

共聚焦中针孔的作用

共聚焦显微镜的针孔是为了在空间上过滤分析体（三维激发体），只检测从焦平面产生的拉曼散射，产生于焦平面以上或以下的拉曼散射不会聚焦到共焦平面上，被共焦针孔遮挡而未被检测到。与此相反，来自焦平面的拉曼散射被带到共焦平面的焦点上，通过针孔并被检测到（激发焦点内部的拉曼散射也将聚焦在针孔处）。这就是“共聚焦”这个词的意思。

光学纵向成像

使用共焦针孔的最 大优势是它可以提供轴向(沿Z轴)分辨率。针孔将探测到的拉曼散射限制在以焦平面为中心的小体积薄片上。因此，显微镜可以聚焦到样品内部感兴趣的深度，拉曼光谱能从选定的焦平面测量。通过移动横向(X-Y)平面扫描显微镜台，可以创建焦平面区域的二维拉曼图像，进行样品内部的化学成分无损成像。针孔是必不可少的。如果没有它，失焦的拉曼散射也会被检测到，将导致图像模糊和较差的轴向分辨率；针孔增加了图像对比度，提高了轴向分辨率。

显微镜台也可以沿着Z轴方向进行移动，以改变样品内焦平面的深度。拉曼光谱的变化以Z轴为基准可以生成一个深度剖面，显示化学成分的轴向变化。这特别适用于多层样品的分析。PET和PVC聚合物具有独特的拉曼光谱，拉曼纵向剖面图可以识别PET-PVC-PET聚合物层状分布。

图1 PET-PVC-PET层状聚合物拉曼纵向剖面图像

在实际样品测试时，横向分辨率经常受到较差图像对比度的限制，而不是显微镜的衍射光学性能的限制。针孔技术提高横向分辨率是通过抑 制杂散光来提高图像的对比度。图2显示了硅质基底上聚苯乙烯球的拉曼图像，随着针孔直径的减少，球体的分辨率明显改善。

图2 不同针孔下（100μm和25μm）的硅质基底聚苯乙烯球拉曼成像

使用共聚焦技术（针孔技术）的显微镜与传统显微镜相比，分辨率提高40%。针孔也能够阻挡失焦散射和其他不需要的背景光，如荧光，减少了背景，增加了图像对比度；显著提高有效横向分辨率。

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