前言
黄曲霉毒素(Afatoxin,AF)作为黄曲霉和寄生曲霉的一类次级代谢产物,最 早发现于20世纪60年代。现阶段已知其衍生产物约20余种(B1、B2、G1、G2、M1、M2等),广泛存在于药材中。
值得关注的是,黄曲霉毒素一直被世界卫生组织(WHO)癌症研究机构划定为I类致癌物,是一种毒性极强的剧毒物质(其中B1毒性最 强),所以国际上对于霉菌毒素含量都有非常严格的限量要求。
目前,对于药材中B族和G族黄曲霉毒素的检测方法,主要参考如下标准:
《中国药典》2020版,2351通则(具体项目见表1)
对于常规反相液相色谱,由于所用的溶剂(水、甲醇、乙腈)会使黄曲霉毒素B1和G1发生荧光猝灭现象,很难直接测定。所以为了克服这一现象,通常选用柱前或柱后衍生的方式,来增加B1和G1的荧光响应值,以满足检测标准的需求。
目前常见的衍生方法有:TFA(三氟乙酸)柱前衍生法、柱后溴/碘试剂衍生法、柱后光化学衍生法以及柱后电化学衍生法。其中柱前衍生前处理过程较复杂、自动化程度低,所以现在主流方式为柱后衍生法,操作简单,灵敏度高。
本应用介绍了三种柱后衍生方案,使用赛里安LC6000高效液相色谱仪,配备高灵敏度的荧光检测器(FL 6440)。三种方案均能满足检测标准的需求,而从使用便捷性和灵敏度方面考虑,柱后光化学衍生法更为简便。
▼ 表1 2020版《中国药典》检测黄曲霉毒素的药材品种
柱后碘衍生方案
参照2020年新版《中国药典》2351通则中真菌毒素测定法,以0.05%的碘溶液为衍生试剂,使用赛里安 LC6000高效液相色谱仪四元梯度系统,搭配荧光检测器和柱后衍生单元测定四种黄曲霉毒素。
色谱条件
标准谱图示例
从谱图可以看出,使用柱后碘衍生法测定,四种黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2得到了很好的分离,分离度均大于1.5,满足药典要求。
得益于赛里安 FL6440 高灵敏度的荧光检测器,四种黄曲霉毒素的最 低检出限远小于2020药典所规定的B1、G1检出限0.5μg/kg(约0.30ng/mL)以及B2、G2检出限0.2μg/kg(约 0.12ng/mL)。
▲ 柱后碘衍生法标样谱图
▲ 柱后碘衍生法检出限谱图
柱后溴衍生方案
参考柱后溴衍生的检测方法,使用50mg/L三溴化吡啶作为衍生试剂,同样采用赛里安LC6000高效液相色谱仪四元梯度系统,搭配荧光检测器和柱后衍生单元测定四种黄曲霉毒素。
色谱条件
标准谱图示例
使用与碘衍生法相同浓度的标准品溶液,但是进样量有所差异。结果可见,B1、B2、G1、G2四种黄曲霉毒素同样实现了基线分离。
从检出限上看,B1和G1检出限为0.03μg/kg(约0.075ng/mL),B2和G2检出限为0.01μg/kg(约0.025ng/mL),实验结果完全满足。
▲ 柱后溴衍生法标样谱图
▲ 柱后碘衍生法检出限谱图
柱后光化学衍生方案
与柱后溴/碘试剂衍生相比,柱后光化学衍生具备更好的易用性。配置上光衍生单元连接于色谱柱和荧光检测器中间即可直接使用,同时无需配制任何化学试剂。操作简便的同时,灵敏度也能得到有效保证,特别适用于大量样品的常规分析测定。
色谱条件
标准谱图示例
配制标准系列工作溶液:黄曲霉毒素B1和G1浓度0.1~50ng/mL、B2和G2浓度0.03~15ng/mL。按上述测试条件测试并建立标准曲线(如图所示),黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准工作曲线线性相关性r2均为 0.9999。
可见,采用柱后光化学衍生结合荧光检测器进行测定,可以满足法规对于黄曲霉毒素的检测需要,并且相比其他方法更易与操作。
▲ 黄曲霉毒素B1和G1的标准曲线
▲ 黄曲霉毒素B2和G2的标准曲线
▲ 柱后光化学衍生法标样谱图
▲ 柱后光化学衍生法检出限谱图
结论
本应用介绍了三种柱后衍生方案,均使用赛里安LC6000高效液相色谱仪(配备高灵敏度的荧光检测器)。实验结果可靠,且能够满足各项标准对于黄曲霉毒素检测的灵敏度要求,尤其是对药材在生产储存过程中的品质把控提供了解决方案。
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