凝胶过滤法实验步骤简述

1.凝胶的选择

根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G25或G50，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。

2.凝胶的预处理

称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。

凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量

为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。

3.装柱

层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于ZX的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1:5～1:25；对于纯化蛋白质来说应为1:20～1:100。

4.加样与洗脱

样品体积不宜过多，Z好为床体积的1%～5%，Z多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。

洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/LpH6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/LNaCl）和0.1Mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/LNaCl）。

5.洗脱液收集

利用自动分步收集器收集，并以20%磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。

6.凝胶柱的重复使用与保存

当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：

（1）在液相中保存Z方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（如0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。

（2）用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。

（3）长期不用者，Z好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，Z后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。