氨基酸分析仪原理

1. 氨基酸分析仪原理

氨基酸分析仪是在离子交换色谱的原理指导下制成的，是一种专门用来分析氨基酸的液相色谱仪。它的结构一般是由色谱系统、自动加样系统、检测系统、控制系统、数据处理系统组成。流程图的主要部件有，进行氨基酸分离的离子交换树脂色谱柱;分离的各个氨基酸与茚三酮试剂反应的水浴(100℃±1℃);用于检测氨基酸显色的比色计及记录仪和数据处理系统;输送缓冲液和茚三酮试剂的恒流泵;缓冲液自动转换阀;自动进样器;保持色谱柱分离温度的恒温水浴。

用于氨基酸分析的样品都需用pH2.2的缓冲液溶解或配制，由于pH2.2都较各种氨基酸的等电点小，即各氨基酸都处于[H+]浓度很大的酸性溶液中，这样的溶液有利于氨基酸的氨基(―NH2)电离，而不利于羧基(―COOH)的电离。因此，在pH2.2的缓冲液中各氨基酸呈R―CH―COOH状态，带正电荷。柱里的磺酸型阳离子交换树脂R―SO3-H+被柠檬酸钠(生理体液为柠檬酸锂)缓冲液平衡时形成R―SO3-Na+。当带正电荷的氨基酸进入色谱柱前端，此时氨基酸浓度处于Z大值，氨基酸与Na+进行如下交换：

由于缓冲液的流动以及氨基酸的吸着，氨基酸在流动相中的浓度下降，这时氨基酸就会解吸，这种解吸作用使交换树脂恢复到原来的形式。这样当氨基酸通过离子色谱柱时，连续地吸着与解吸，加之各种氨基酸彼此性质不同，吸着的程度就有差异，在缓冲液的作用下便形成了分离。当逐渐提高洗脱缓冲液的pH值时，氨基酸的正电荷逐渐减少，与树脂的结合力逐渐减弱，Z后从离子色谱柱被洗脱下来。 氨基酸的结构不同，与树脂的结合力也有差异。酸性氨基酸所带的氨基少，正电荷也少，与树脂结合不紧，它容易被洗脱下来。如天门冬氨酸，是diyi个洗脱下来的氨基酸，其等电点为：

天门冬氨酸等电点(pI)=½(2.1+3.9)=3.0

相反，赖氨酸所带的氨基(―NH2)多，在pH2.2缓冲液中，正电荷多，它与树脂结合紧密，被Na+置换困难，故洗脱下来的速度就慢。

赖氨酸的等电点(pI)=½(9.0+10.5)=9.75

氨基酸侧链除具有氨基和羧基外，有的氨基酸还带有其他基团，这些基团在一定条件下也能离解，如酚羟基(酪氨酸)、咪唑基(组氨酸)及胍基(精氨酸)等，在一定条件下，这些基团的解离状态及它们对树脂的亲和力和被洗脱的速度是有区别的，这些区别是各氨基酸在色谱柱被分离的基础。 不同氨基酸与离子交换树脂亲和力的强弱如下： 碱性氨基酸>芳香族氨基酸>中性氨基酸>酸性及羟基氨基酸。

因此，氨基酸的分离便有先后顺序，一般酸性及带羟基的氨基酸Z先洗脱下来，然后是中性氨基酸，Z后是碱性氨基酸。

氨基酸的分离是用不同pH值的缓冲液进行的，一般标准分析(蛋白质水解液分析)采用柠檬酸缓冲液，如果分析生理体液(如尿、血浆、乳汁、脑脊液及动植物组织提取液等)则该为柠檬酸锂缓冲液，因为天门冬酰胺与谷氨酰胺在钠盐缓冲液中不易分离，两者重叠成一个峰，不能得出各自的结果。 标准氨基酸分析(蛋白质水解液分析)，Beckman 121MB型一般使用三种缓冲液。即pH3.28洗出天门冬、苏、丝、谷、脯、甘、丙、胱、缬等氨基酸;pH3.90洗出蛋、异亮、亮、酪、苯丙等氨基酸;pH4.95洗出赖、组、精等氨基酸。 除以上缓冲液外，还有再生液，浓度为0.2mol/L NaOH。每做完一个样品，仪器自动吸入再生液，将柱子冲洗干净后，再做第二个样品。

洗脱出来的氨基酸与另yi流路的茚三酮溶液混合，在100℃的水浴中起显色反应。一般氨基酸反应后呈蓝色，但脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色。故氨基酸分析仪一般都设计有二个频道，一个为570nm，一个为440nm。显色后，流经分光光度计比色，比色后的信号经放大以后输入记录仪和积分仪，Z后打印出结果。