梯度洗脱

梯度洗脱是在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，就是梯度洗脱，也被叫做梯度淋洗或程序洗脱。在气相色谱中，为了改善对宽沸程样品的分离和缩短分析周期，广泛采用程序升温的方法。而在液相色谱中对组分复杂的样品则采用梯度洗脱的方法。在同一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。

梯度洗脱的机理

简单来说，梯度洗脱原理是流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品中的所有组分可在Z短时间内实现Z佳分离。

梯度洗脱原理具体地讲就是，当样品随梯度起点的流动相进入色谱柱入口时，由于起点流动相中强洗脱溶剂B含量较低，化合物C1(保留性适中)和化合物C2(保留较强)因分配系数(k值)较高而滞留于色谱柱入口附近，几乎未移动。一段时间后，B增加到一定数值，C1的k值达到足够小(比如小于10)，其在柱中的移动速率明显增大，并且随着B的增加，其移动速率愈加快速，直到tC1时流出色谱柱，被检测器检测到并被记录成色谱峰C1，tC1虽然比等度时的保留时间长很多，但C1的的平均k值却很小，因而色谱峰并未展宽，灵敏度仍处于较高水平。B持续增加，在随后的某个时间点，C2的k值也降到10以下，C2的移动速率也开始变快，以与C1类似的方式于tC2被洗脱出色谱柱，其平均k值同样很小，色谱峰亦未展宽，灵敏度处于较高水平。

梯度洗脱要求

在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：

①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。

③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的Z大压力。

④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。

梯度洗脱可分为低压梯度(又称为外梯度)和高压梯度(又称为内梯度)。

(1)低压梯度装置。低压梯度是采用比例调节阀，在常压下预先按一定的程序将溶剂混

合后，再用泵输入色谱柱系统，也称为泵前混合。

(2)高压梯度装置。由两台(或多台)高压输液泵、梯度程序控制器(或计算机及接口板控

制)、混合器等部件所组成。两台(或多台)泵分别将两种(或多种)极性不同的溶剂输入混合

器，经充分混合后进入色谱柱系统。

梯度洗脱的特点

提高柱效，改善检测器的灵敏度。当样品中的一个峰的k值和Z后一个峰的k值相差几十倍至几百倍时，使用梯度洗脱效果特别好。梯度洗脱中为保证流速的稳定，必须使用恒流泵，否则难获重复结果。梯度洗脱常用一个弱极性的溶剂A和一个强极性的溶剂B。

两个容器放于同一水平上，两容器连通，B与柱相连，当溶液由B流入柱时，A中的溶液就会自动来补充，经搅拌与diyi容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。

梯度洗脱时，将在分离过程中按照一定的程序，连续改变两种（或多种）极性不同的流动相的浓度配比和极性，并通过流动相极性的变化进而改变被分离样品的选择因子值和保留时间，以使色谱柱具有更好的选择性和更大的峰容量。采用梯度洗脱技术可以提高分离度、缩短分析时间、提高灵敏度。此方式适于分离复杂混合物，特别是保留性能相差较大的混合物。

当使用反相色谱时，逐步提高有机相含量，额可以使得在色谱柱上强保留物质更快速洗脱下来，节约分析时间，

梯度洗脱与等度洗脱有什么区别？

梯度洗脱：在同一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比

等度洗脱则是指从头到尾只是用同一个流动相。

用不用梯度洗脱，主要看杂质的情况。同一物质有梯度和等度两种条件时，梯度的认可度较高。杂质与杂质、主峰、溶剂峰的分离度一定要好（不好的话就要用梯度）。

（1）杂质和主成分极性相差很大，杂质一定要全部都能洗脱出来（有时等度情况下从两三个小时杂质也冲出不来，就必须考虑等度）。

（2）杂质和主成分极性相差较大，杂质出峰太晚（等度冲两个小时出来个杂质，就可以通过梯度缩短检样时间）

（3）还有就是杂质极性比主峰的大，等度时要想主峰时间合适杂质全堆在前边，杂质分开主峰又出峰太晚，这种情况也得考虑梯度洗脱。

在能达到较好的分离度的情况下能用等度就用等度，毕竟用梯度要麻烦一些。