恐惧的DCS胶囊-消除恐惧

你知道吗？

       从18世纪血球计数板首次被应用于分析病人血液样本以来，逐渐发展为实验室细胞计数的标准工具。

       但是由于其本身固有设计的简易性和使用过程的复杂性，导致其计数结果会有一个必然的误差。其误差主要来源于人为操作因素：

细胞悬液的混匀

       均匀细胞悬液的准备对计数结果的准确性至关重要。对于某些极易聚团或未能均匀打散的细胞悬液，人工计数时，往往不易识别。

细胞悬液的稀释

       依据大多数实验室的习惯，通常会采取对四个顶角的大格内的细胞进行统计计数，每个大格的细胞一般落在30-50个之间时，计数结果会更加准确。这就意味着，细胞悬液过浓或者是过稀都不利于获得准确的结果。多数情况下，我们需要对悬液进行有效的稀释。

盖玻片的摆放

       据一项研究表明，在计数过程中，盖玻片的位置不准确可造成7.6%的计数差异。

人工计数过程的误差

       一项实验表明，不同操作者之间的计数差异能高达52%，而同一个操作者的计数差异为20%。在计数过程中，往往需要同一个人在相同的条件下进行多次计数以消除误差。（即使这样，也可能会产生20%的误差）

人为计算过程的误差

       通过计数板获取的数据结果，需要通过一系列的计算，从而转化成实际的细胞浓度数据。再乘以细胞原液的稀释倍数（如台盼蓝的稀释等），方能得到所需样品的细胞浓度。计算过程中的误差也会影响到Z终的实验结果。

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上一期，我们通过了解动物恐惧记忆相关的两种研究——穿梭实验与跳台实验，探究了通过特定的场景刺激（强光、电流和声音等）使小鼠产生恐惧记忆，经过一定时间强化后，环境与刺激两者被小鼠联系在一起，当小鼠再次回到该环境中便会出现恐惧相关行为的两种实验流程。

本期，我们将继续介绍两种研究小鼠恐惧记忆的测试——避暗实验与巴恩斯迷宫实验，探究动物大脑储存恐惧记忆的奥秘。

避暗实验

01.原理

利用鼠类的嗜暗习性设计，主要测试动物对明暗辨别觉的学习记忆能力。动物由于嗜暗习性而偏好进入和停留在暗室，当动物进入暗室或停留暗室时则会受到电击，动物为了避免受到电击伤害就会寻找安全区（明室），经几次反复后，ZZ记住安全区域。

02.实验材料

03.实验方法

适应期

实验开始前3-7天，每天抓取、轻抚动物，让其适应被实验人员抓取，避免实验过程中因实验人员抓取而造成动物处于应激状态，造成实验结果不可靠的问题。

建模期

① 时间：第 一天② 强度：

• 大鼠：电流：0.65-1.8mA（推荐0.8mA），或，电压65-70V。

• 小鼠：电流：0.15-0.6mA（推荐0.25mA），或，电压30-36V。

③ 频率：5-15Hz电流。

④ 刺激方法：实验开始前，将动物放入暗箱，适应5分钟。随后对暗箱进行通电，持续5分钟，此时明箱底部没有通电。

测试期

① 时间：第二天② 方法：将动物放进明箱，不进行通电，记录5分钟。

04.数据分析

①物活动轨迹，动物第 一次进入暗箱的时间（潜伏期），分别在两个箱体的活动时间，活动距离。

② P<0.05认为具有统计学显著性差异。

05.注意事项

• 选择体重均匀动物进行实验，测试时大鼠体重需<300g，确保体重不影响电击效果。

• 不同品系动物本身会有区别，常规推荐使用C57BL/6J小鼠和SD大鼠。

• 实验前后注意清理电击栅栏中的动物排泄物（排泄物会影响通电性及损坏电发生器）。

• 环境清理，通过酒精擦拭、晾干尽可能去除上一只动物气味，仪器设备具有通风性。

巴恩斯迷宫实验

01.原理

1979年，Barnes 建立了巴恩斯迷宫，与水迷宫和放射臂迷宫类似，它是基于啮齿类动物天生的探索特性，应用噪音、强光和暴露的开放环境作为应激手段，促使动物寻找目标洞。经过训练，动物学习并记忆目标箱的位置。该实验的优点在于对动物的应激性刺激较小，既不像放射臂迷宫那样需要禁食，也不像水迷宫那样应激性强。因此，在记忆研究中较为常用。尤其适用于与应激相关的记忆研究以及基因敲除小鼠的行为表型研究。

02.实验材料

巴恩斯迷宫，smart3.0

03.实验方法

① 实验开始前3-7天，每天抓取、轻抚动物，让其适应被实验人员抓取，避免实验过程中因实验人员抓取而造成动物处于应激状态，造成实验结果不可靠的问题。

② 实验第1天，将动物从目标孔洞放入目标箱内适应4分钟（只进行这一次）。

③ 实验第2-7天，将动物移动至平台中 央，用透明圆筒限制活动5秒，后撤掉圆筒开始计时，同时给与动物刺激（强光，声音等）。

• 动物成功进入目标箱，则让动物在目标箱内停留30秒。

• 若动物4分钟内没有找到目标箱，则诱导动物进入目标箱，停留30秒。

④ 随机转动圆盘，使孔位与上一次实验不同，但目标箱的方位始终保持不变。每天重复2次上一步的实验流程。

04.数据分析

① 第 一次探究洞的潜伏期，到达目标洞的时间，每只动物的错误次数（探究一个错误的洞即视为错误一次）。

• 潜伏期仅做参考，潜伏期越短，说明动物学会了迷宫原理，记忆水平越好。

• 到达目标洞的时间越短，说明动物记忆水平越好。

• 动物错误次数越多，说明动物学会了迷宫原理，但没有记住目标箱的位置。

② 采用单因素方差分析（one way-ANOVA），当多组间有差异时，两两比较采用Fisher's LSD post hoc多重比较方法。

③P<0.05认为具有统计学显著性差异。

05.注意事项

• 每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味。

• 不同品系动物对此实验的偏好性有很大不同，建议使用C57BL/6J小鼠进行实验。

【参考文献】

Rosenfeld Cheryl S,Ferguson Sherry A,Barnes maze testing strategies with small and large rodent models.[J] .J Vis Exp, 2014, undefined: e51194.

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文献精读第36期

记忆印迹是学习或经验相关记忆产生的关键，联想恐惧记忆的形成主要归因于谷氨酸能投射神经元（Projection Neurons, PNs），这些神经元具备经验依赖的可塑性。然而，GABA能中间神经元（Interneurons, INs）也会对记忆相关的线索做出反应，并广泛地调节PNs的功能。但是，学习是否需要特定的INs选择性地参与记忆编码仍然是一个悬而未决的问题。

2022年8月1日，美国西奈山伊坎医学院和阿拉巴马大学伯明翰医学院的研究人员在《Neuron》期刊上发表题为“Control of fear by discrete prefrontal GABAergic populations encoding valence-specific information”的文章。该文章证实，积极和消极的体验能够激活前额叶生长抑素中间神经元（Somatostatin Interneurons, SST-INs）的离散群体，这些不同的SST-INs离散群体能够对恐惧记忆形成相反的控制。研究的结果强调了INs在情绪学习中的重要作用。

小清蛋白中间神经元（Parvalbumin Interneurons, PV-INs）、血管活性肠肽中间神经元（Vasoactive Intestinal Peptide Interneurons, VIP-INs）以及SST-INs在记忆获取和巩固的环路动态编码过程中发挥了关键作用。该文章作者最近的研究（Cummings and Clem, Nat. Neurosci., 2020）证明了边缘前皮层（Prelimbic Cortex, PL）中的SST-INs在听觉恐惧条件训练后表现出突触效能增强以及线索诱发的活动，这表明它们参与了记忆形成。作者进一步证明，SST-INs通过激活大脑中的网络来控制动物防御性的僵直行为，而这一效果可能是通过缓解PV-INs介导的抑 制来协调的。

在该研究中，作者使用基因标记的方法，探讨了SST-INs作为离散细胞群的一部分是否在记忆编码中起作用。在小鼠条件恐惧实验中，学习过程主要激活PL中的SST-INs，而非PV-INs和VIP-INs。随后，作者进一步证明，这些被激活的SST-INs在记忆提取过程中优先被再次激活。并且，作者通过结合光遗传学的手段证实，这些SST-INs控制着恐惧线索诱导的小鼠僵直行为。此外，作者还通过电生理实验证实，恐惧学习激活的SST-INs表现出独特的输入和输出突触传递特性。这些结果表明，PL中的SST-INs在恐惧记忆编码中起着关键作用。

综上所述，条件恐惧记忆依赖于PL中解剖上和功能上离散的SST-INs群体，但是受到奖赏相关的SST-INs的正交网络的相反控制。该研究为记忆编码中细胞特异性的GABA能微环路提供了重要见解，并概述了在行为可塑性过程中INs可能变得功能特异化的突触机制。

研究方法亮点

这项工作阐述了PL中不同的SST-INs离散群体在恐惧记忆表达中的作用。该研究用到了脑立体定位注射、光遗传学、电生理记录、行为学评估以及免疫组化等实验技术。瑞沃德深耕生命科学研究领域20年，一直致力于为客户提供可信赖的解决方案和服务。瑞沃德可提供该研究所涉及的脑立体定位注射、光遗传学、电生理记录、行为学评估以及免疫组化的完整解决方案。截至目前，瑞沃德产品及服务覆盖海内外100多个国家和地区，客户涵盖全/球700+医院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全/球科研人员发表SCI文章14500+，获得行业广泛认可。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.07.004