PCR与DNA复制有何异同？

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  小东77523 2016-12-02 03:52:50

  PCR是DNA的体外扩增技术. DNA复制是有生命力的细胞在体内 自我复制的过程 ，属于体内扩增. PCR(聚合酶链式反应)原理 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成： 即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的Z适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 DNA复制过程: (一)复制的起始 1.螺旋的松弛与解链 ⑴拓扑异构酶---能改变DNA空间构像的酶 作用：DNA复制时松弛超螺旋，以利复制叉的行进及DNA合成，合成后再引向超螺旋。 功能：不清楚，可催化体外拓扑异构化反应，拓扑异构酶分两型。 拓扑异构酶I （topoisomerase-- I ） 作用：松弛超螺旋，不需ATP， 作用机制：切开环状一条链、打结与解结 原核：拓扑异构酶I对负超螺旋作用>正超螺旋 真核：拓扑异构酶I对正、负超螺旋均有作用。 拓扑异构酶Ⅱ---旋转酶（gyrase） 作用：松弛超螺旋，作用机制： 切开环状两条链、打结与解结、环连与解环连 ⑵解链酶 （helicase）---复制蛋白rep 作用：ATP供能时，解开DNA双链。 原核：编码解链酶的基因是dnaB。前导链结合rep蛋白，随从链结合解链酶II、Ⅲ ⑶单链结合蛋白（SSB） 作用：SSB与解开DNA单链结合，保护稳定DNA。与新复制DNA单链结合，以防其降解。 螺旋松弛与解链过程如图所示 2.引发 ⑴引物酶（primase） 作用：以DNA为模板，自5'→3'合成RNA小片段约十几到几十个核苷酸， 3'末端为-OH。 原核：dnaG基因编码DnaG蛋白即引物酶。 ⑵引发前体（preprimosome） 由多种蛋白因子组成复合物。 作用：合成RNA引物，沿随从链复制叉的行进方向移动，在不同部位，合成RNA引物。 小结：合成RNA引物，在引物3'-OH末段进行DNA片段合成。 二 DNA链的延长 反应体系：DNA模板，DNA聚合酶，dNTP，引物，Mg2+ 反应式：DNA+dNTP→（DNA）n+1+ppi 真核与原核中DNA聚合酶（DNA polymorase-DNApol）： 有几种类型，作用方式相同，但各具特性及功能。 1.大肠杆菌DNA聚合酶（3种） ⑴pol I：催化5'→3'的聚合作用，合成20个核苷酸即离开模板，填充空隙。 3'→5'外切酶活性，去除错误碱基，有校对作用。 5'→3'外切酶活性，去除RNA引物及修正错误碱基。 ⑵pol II：催化5'→3' DNA合成并具有3'→5'外切酶活性，体内功能不清楚。 ⑶pol Ⅲ: DNA链延长起主要作用，细菌中以1000dNTP/秒进行聚合反应。 3'→5'外切酶活性，校对作用，与pol I配合使错误率降至10-6。如图所示 DNA复制的保真性：遵守严格的碱基配对规律。-聚合酶对碱基的选择功能。聚合酶对错误碱基的校读作用。以上三种作用确保了DNA复制的准确性。 2、真核生物DNA聚合酶 特性与大肠杆菌相似，共五种：α、β、γ、δ、ε ⑴polδ：催化前导链及随从链的合成，需增殖细胞核抗原蛋白PCNA的参与。 ⑵polα：与引发酶配合，参与随从链的合成。 ⑶RFA（replication factor A）：DNA延长中RFA与单链结合起到SSB的作用。 三终止 连接酶（ligase）：使相邻的DNA片段，以3'，5'磷酸二酯键相连，需ATP供能。

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