植物的基因怎样提取？？

参与评论

评论

登录后参与评论

全部评论(1条)

• 

  lqqqianqi 2016-11-21 00:00:00

  植物DNA提取方法 方法一： 1.取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65℃水浴锅中保温约60min。 2.待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI（氯仿：异戊醇=24：1）溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min，取上清液转入另一干净的离心管中。 3.重复步骤（2）一次。 4.取步骤（3）上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA 4℃，12000rpm离心10min。 5.弃去上层有机溶剂，加500ul75%乙醇洗涤沉淀，4℃下8000rpm离心5min，弃去上清，洗涤沉淀3次。 6.倒置或者37度培养箱烘干。 7.加50ulTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冷藏备用。 方法二： 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ， 60℃水浴预热。 2. 植物5-10g， 剪碎， 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中， 剧烈摇动混匀， 60℃水浴保温30-60分钟(时间长，DNA产量高)， 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液， 颠倒混匀(需带手套， 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟， 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5mleppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。 7. 如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟， 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。 8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。 9. 加入5μlRNaseA(10μg/μl)， 37℃ 10分钟， 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀。 11. 用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。 12. 将DNA重溶解于1ml TE， -20贮存。 13. 取2μlDNA样品在0.7% Agarose胶上电泳， 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍， 测定OD260/OD280， 检测DNA含量及质量。 方法三： 植物DNA的SDS提取法： 试验试剂： 1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。 3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。 4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。 5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4·H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9、1mol/LHCl。 10、0.2mol/LNaOH。 11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。 12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。 13、0.05mol/LNaOH。 14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

  赞(7)

  回复(0)

  评论

  评论

  登录后参与评论