如何用quantity one 计算电泳条带的灰度值

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  jxsrzhb521 2016-12-01 18:05:41

  样品制备： 变性条件——SDS LB直接裂解： 用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘，LB久煮某些性质会改变）的1*SDSLB（或者略高1.5*）直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDSLB都是过量的（因此不一定要严格参考SDS LB稀释比）；如果SDSLB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现tip吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。这时候常规做法有两种，1.再煮5min。常规煮样时间3-5min，样品过浓时就煮10min；2.如果10min煮样后，仍然吸不起来，才适当增加SDSLB，继续煮；也可以对样品进行超声。煮样时间若过长，蛋白会凝固，此时以失去继续WB的意义，请丢弃（判断标准：出现明显的蛋白沉淀和水分层） 此方法的缺点，SDS LB煮过的样品如果用来做IP，需要特殊方法，因此，这种制备方法制备的样品有使用局限。 非变性裂解法（不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了，其实类似） 裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。 俺前boss nature文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl， pH7.6， 100mM NaCl， 20mM KCl，1.5mM MgCl2， 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin，10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶YZ剂很复杂也很贵，其实用0.5mMPMSF替代这三种就好了；如果还要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（现加现用），10 mM NaF， 1 mM Na3VO4， 50 mMbeta-GP。 此方法的优点：NaCl浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较为温和，便于随后的IP等试验。其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见，诸如0.15M（生理盐浓度）、0.3M、0.6M（高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下适合IP试验，0.6M及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。 用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40，用于破坏核膜结构；可用到1%，但此时染色体会析出，沉淀粘稠。 组织块裂解： 组织块较大用匀浆的方法Z合适，现在有不少转头很小的匀浆器。 当组织超微量的时候，比如50mg新鲜癌组织，我采用的方法是 1. 低温（剪）搅碎，成肉糜状。 2. 锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击（控制力量，尽量避免弄破锡箔纸），进一步破碎；反复多次。 3. 用上述细胞裂解液回收。 分泌型蛋白富集： 用无血清培养基培养细胞，收集上清液用于WB检测；如果含量过低，需要用TCA沉淀富集。 “乘机安全小贴士”安全出行要重视 理论上，从普通培养基中收集分泌蛋白，此时对细胞生长条件的影响Z小，是Z佳的实验条件；但是这存在隐忧。因为含血清的培养基中含有非常丰富的BSA（牛血清白蛋白）之类的蛋白质，除非你进一步分离纯化，否则直接用这种样品去WB会有非常大的麻烦，尤其当你的蛋白在60-46kDa之间的时候；用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片非常强的信号。因为此区间蛋白（主要是BSA）浓度过于富集，会非特异性粘附“任意”抗体，从而Z终被识别。同理，采用SDS LB裂解细胞制备样品前，通常要用PBS洗涤，其目的之一是去除培养基中的BSA。 采用无血清培养基收集细胞上清除了改变细胞的生理状态外（可能激活未知信号途径，诸如AKT等），还会出现的问题是： 1. 即使采用了无血清收集上清，仍然有大量杂蛋白，但相对好很多。 2. 选用了上清，由于蛋白浓度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。 a. TCA沉淀对半定量操作要求非常高，因为很容易沉淀不充分或者离心操作丢失，尤其在离心过程，离心管的摆放非常讲究，要180度翻转离心两次。 b。重新溶解时，由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的条件，相对麻烦。 实际上，如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建议检测上清，尤其半定量的WB实验检测不同样品间的差异。这里面有实验操作细节的麻烦——经验之谈，我曾经参与的cancer cell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的数据是celllysis；偶尔用到上清，也只是作为富集纯化该蛋白的原料，为进一步分析做准备。 样品制备完，应立即低温保存（-20度短期（几天）；-80度长期；例外，IP用样品应直接进行IP，避免冻融破坏蛋白质间弱的相互作用）。SDSLB煮沸过的样品冻融会存在另一个问题，SDS沉淀；SDS 4度就会沉淀，何况-80度。上样前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带（SDSLB不够，样品未充分溶解也会出现类似拖尾；上样过大也会）。 在样品制备过程中，另一个需要注意的问题是，从样品制备的起始阶段就要注意定量问题；WB本身系统误差有20%，太细微的差别经常忽略不计。细胞样品可以先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。组织样品，从肿瘤组织的大小（称重）开始，裂解液的体积都是精确定量的，操作过程也尽量避免蛋白损失。有人会说可以电泳前蛋白定量，我将下一节讨论蛋白定量的不科学性，以及裂解液成分对定量的干扰。 蛋白电泳： 电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。经验之谈，8%胶Z底边约36KDa，10%Z底边约25KDa，12%Z底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白，转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果的影响都问题不大（300KDa蛋白如何，没有尝试过）。 电泳一般采用恒流，45mA-55mA（应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器Z高限压；此条件适合gibco modelV16型，胶宽20cm）。采用恒流的优点，保证Z快速度完成电泳（电压会逐渐增大），省时且减少扩散；但是由于电泳速度过快时会发热而溶胶，所以你必须想办法散热。散热不好，条带出现波浪状。

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