复杂食品基质中四环素的检测

     目前复杂基质中四环素类化合物的检测方法主要参照GB/T 23409-2009、GB/T 23409-2009、 GB/T 20764-2006和GB/T 22990-2008。但是国标的方法普遍存在以下的缺陷：

      安谱实验成功开发出CNW II代四环素检测专用SPE专用柱，与HLB串联使用，针对各种复杂食品基质（蜂蜜、牛奶、猪肉、猪肝等），实验过程方便，无需氮吹，回收率高且稳定，杂峰少。

一、样品前处理

     准确称量2g样品（精确到0.01g），加入四环素标品（上机的加标浓度5ppm），加入20mL Na2 EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液，涡旋混合2min后，于35°C超声20min，然后4000r/min，离心10min，上层溶液过滤至另一个50mL离心管。重复提取一次，上清液过滤后收集，将两次过滤后的溶液混合，取10mL上清液后离心取上清，待上样。

二、SPE操作过程

小柱：Poly-sery HLB小柱 (SBEQ-CA3181)

活化：5mL甲醇

平衡：10mL水

上样：提取液 

淋洗：5mL甲醇-水溶液（5: 95）

洗脱：5mL甲醇，洗脱后，向洗脱液中加氨水，使pH值在8-10之间。

小柱：CNW II代四环素检测专用SPE小柱（复杂基质）(SBEQ-CA6980)

活化：5mL甲醇

平衡：5mL 5%氨水甲醇

上样：HLB小柱的洗脱液 

淋洗：5 mL 甲醇

洗脱：4mL洗脱液（甲醇-乙腈-0.01M草酸（pH 2.00）1.5: 1.5: 7）

从洗脱液中取部分样品至2mL进样小瓶，待HPLC-UV检测

三、色谱条件

色谱柱：Athena C18, 250mm*4.6mm，5µm

流动相：乙腈/甲醇/草酸（0.01M）=1.5:1.5:7，pH=2.0

流速：1.0mL/min

柱温：30°C

进样量：10µL

检测器：紫外（361nm）

四、实验谱图

五、实验数据

结论：HLB+四环素专用柱在净化复杂基质时，可以避免HLB+WCX的柱子回收率骤降的现象，保证高回收率，同时可以去除许多杂质。

六、实验耗材

关注

安谱实验电商平台

开启线上一站式采购

www.anpel.com.cn

《GB 5009.168-2016 食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》适用于食用油、乳粉等食品中脂肪酸的检测。在开展食品脂肪酸的检测时，实验员经常会遇到各种小问题，小编今天整理了一些常见问题进行分享学习。

\ 脂肪酸甲酯和脂肪酸甘油三酯标准品如何选择？/

国标《GB 5009.168-2016 食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》按照定量方法分为三个方法，分别是内标法、外标法和归一化法。内标法需要使用37种脂肪酸甲酯混标作为定性外标，十一碳酸甘油三酯作为定量内标；外标法需要使用相应的脂肪酸甘油三酯作为定量外标；归一化法需要使用37种脂肪酸甲酯混标作为定性外标。

\ 37种脂肪酸甲酯混标如何使用，

内标法如何配置标准曲线？/

上图为国标GB 5009.168-2016 标准截图，可以看出，内标法需要配置5mg/mL十一碳酸甘油三酯的内标溶液；而混合脂肪酸甲酯标液不需要配置标准曲线，仅用于定性和脂肪酸甲酯响应因子的计算。

如果选购安谱实验的37种脂肪酸甲酯混合标液（CDAA-252795-MIX-1ml，不同浓度于异辛烷，总计10 mg/mL），建议取1.0mL 混合标液稀释至5mL或10mL，得到总计2mg/mL或1mg/mL的37种脂肪酸甲酯混合标准使用液。

内标法的计算公式见上图，可以看出，脂肪酸甲酯混标的作用主要是用来计算脂肪酸甲酯相对十一碳酸甲酯的响应因子，因此进样单点的标准溶液即可；样品中脂肪酸甲酯的含量计算主要取决于样品中添加的十一碳酸甲酯内标的含量和样品中各脂肪酸甲酯的峰面积及其响应因子。样品中脂肪酸的含量需要由脂肪酸甲酯的含量再乘以转换系数得到。

\ 使用CD-2560进样37种脂肪酸甲酯为什么只出了36个峰？/

不同品牌、不同规格的色谱柱，色谱柱污染、柱效下降的色谱柱都可能导致37种脂肪酸的分离有所变化，建议可通过调整流速等参数优化色谱条件，以达到最 优分离度。

建议先在 0.8mL/min 的流速条件下查看目标峰的分离情况，根据出峰情况，如果是 31 号和 32 号峰分离变差就增加流速，如果是 24 号峰、30 号峰和 35号峰分离变差就减小流速，通过流速的微调以找到最 优的分离条件。具体调整方法可查看安谱实验相关的单页“37种脂肪酸甲酯分离的小秘密，你知道吗？”。

\ 外标法检测有哪些需要注意？/

如标准截图所示，外标法使用脂肪酸甘油三酯作为标准品，但需要将脂肪酸甘油三酯标准溶液经过酯交换转变为脂肪酸甲酯上机检测，不可直接将脂肪酸甘油三酯直接上机检测，也不可使用脂肪酸甲酯作为外标进行定量计算。

上图为外标法计算公式，可以看出，外标法是直接计算样品中脂肪酸的含量，不需要计算脂肪酸甲酯的含量。通过脂肪酸甘油三酯的单点外标法进行计算，计算结果主要与脂肪酸甘油三酯标准溶液的浓度、脂肪酸甲酯的峰面积和脂肪酸甘油三酯转化为脂肪酸的系数有关。脂肪酸甘油三酯标准溶液浓度的选择可根据实际样品中脂肪酸的含量进行优化调整，使其尽量接近样品中含量。

《GB 5009.257-2016 食品安全国家标准 食品中反式脂肪酸的测定》适用于动植物油脂、氢化植物油、精炼植物油脂及煎炸油和含动植物油脂、氢化植物油、精炼 植物油脂及煎炸油食品中反式脂肪酸的测定。

在开展食品反式脂肪酸的检测时，实验员经常会遇到各种小问题，小编今天整理了一些常见问题进行分享学习。

01

要检测哪些反式脂肪酸，标准品怎么选择？

标准要求检测食品中C16:1t~C22:1t等16种反式脂肪酸。具体目标物信息可参见标准附录A中的“表A.1 脂肪酸甲酯化学信息表”，详见下图。

针对标准要求的反式脂肪酸，安谱实验推荐的标准品选择方案见下表，分别是6种反式单不饱和脂肪酸甲酯、4种十八碳二烯酸甲酯、8种十八碳三烯酸甲酯。

02

反式脂肪酸标品的使用有些什么注意点？

上述推荐的3种反式脂肪酸标准品中十八碳二烯酸甲酯和十八碳三烯酸甲酯均为同分异构体混合物形式，均无准确浓度，这是反式脂肪酸的性质及其生产工艺导致，但这并不影响结果的计算，因为标准中反式脂肪酸的定量方法是面积归一化法，并不需要确定某一个反式脂肪酸的准确浓度，此标准品更重要的作用是目标物的定性。

4种十八碳二烯酸甲酯混标和8种十八碳三烯酸甲酯混标中的目标物信息见下表，可以看出2个混标中分别含有顺-9,12-十八碳二烯酸甲酯（亚油酸甲酯）和顺-9,12,15-十八碳三烯酸甲酯（亚麻酸甲酯）这两种顺式脂肪酸甲酯。因此推荐的3种混标产品中总共含有18个目标物。

03

检测食品中反式脂肪酸

还需要检测其他常见脂肪酸吗？

检测食品中的反式脂肪酸需要同时检测其他顺式脂肪酸，上图为国标中反式脂肪酸的计算公式，反式脂肪酸的定量计算是使用归一化法，从公式可以看出需要计算样品中所有脂肪酸甲酯目标物的校准峰面积。通常我们建议可以和《GB 5009.168-2016 食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》同时检测，因此检测食品中反式脂肪酸还需要采购37种脂肪酸甲酯混标（货号：CDAA-252795-MIX-1ml）进行检测。

需要注意的是“GB 5009.168-2016”和“GB 5009.257-2016”两个标准中脂肪酸的归一化法的计算公式是并不一样，在实际检测过程中需要分别参照标准要求的公式进行计算。下图为使用“GB 5009.257-2016”标准检测大豆油样品中反式脂肪酸的计算公式模板。

04

标准品中有一些脂肪酸甲酯的CAS号和标准不一样？

因不饱和脂肪酸甲酯存在顺反异构，以及顺反物质的混合物，因此可能设计多个CAS号，所以需要对标准品的CAS号信息特别注意。特别是“GB 5009.257-2016”中的CAS号信息情况，详见下表，而在“GB 5009.168-2016”中目标物的CAS号信息均正确无误，各位老师可以结合“GB 5009.168-2016”进行目标物CAS号信息的确认。

05

有一些反式脂肪酸和顺式脂肪酸分离度较差怎么优化？

在脂肪酸检测过程中常常遇到的一个问题是，顺式脂肪酸 C18:3 6c,9c,12c 和一些反式十八碳三烯酸为同分异构体，且在色谱柱上出峰时间完成重合，无法分离，这样就会导致如果样品中有出峰，则无法判定该目标物是反式和顺式的结构，影响结果判定。小编今天提供2种色谱条件的优化方向供各位老师参考。

色谱条件优化1（降低初始温度，降低升温速率）：

该色谱条件下的谱图见下图：

色谱条件优化2（降低初始温度，降低升温速率，使用梯度流速）：

该色谱条件下的谱图见下图：