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定量western blot 一定要有内参质控（上）

Western Blot是生物修炼的一大实验，现在不做定量Western Blot，都不敢自诩学霸的了，暗暗擦汗的有没有？

在讨论如何从Western Blot中获得定量数据之前，先定义一下我们所说的“定量”是什么意思是非常有用的，何为定量，必须符合下列准则：

♦ 使用一个定义的过程进行检测，即Western Blot。

♦ 这个过程产生一个可重复的结果，即是精确度。

♦ 测量反映了一个“真实”的结果，即是准确度。

定量Western Blot除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，是一定要检测内参的，也就是内部参照（Internal Control），目的是校正蛋白质转印和上样过程中导致的实验误差，保证实验结果的准确性。对于哺乳动物细胞表达来说，内参通常指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用其作为参照物。

在发表文章时，Western Blot实验结果需内参进行校正，但仍有一些科研人员在实验中忽略内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范是比较各种样品间上样量等同的唯yi方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，例如BCA方法对还原性试剂兼容性差，Bradford方法对去垢剂兼容性差，A280方法影响因素比较多，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。在Western Blot实验时使用内参，即可简便地对转印和上样步骤产生的误差进行校正。

谁能看出这是“GAPDH”

那么如何实现Western Blot实验中内参的检测呢？简单讲就是在WB过程中，除加入靶标蛋白的抗体外，也加入内参蛋白的抗体，同时实现靶标蛋白和内参蛋白的检测。通过归一化，可以校正上样误差和转印误差，从而获得比较准确的Western Blot结果。

使用荧光方法进行定量Western Blot检测，可进行多重检测，荧光信号稳定，持久，影响因素少，不用剥离膜和剪膜，实验条件一致，更容易获得定量Western Blot的数据。Azure600可以同时进行4通道荧光成像，无需剥离和重孵育，靶标蛋白和内参蛋白同时在一张印迹膜上成像，更容易被期刊杂志接收。

如果蛋白表达是高丰度的，可见荧光方法也可以尝试，如果是3色RGB可见荧光，能够同时检测两种靶标蛋白和一个内参蛋白。

小编列出了常见蛋白质内参，供参考哈：

想了解更多关于内参选择的小伙伴敬请期待下期精彩内容。

上期小编为大家介绍了以单一看家蛋白作为定量Western Blot内参蛋白的分析方法，这次咱不得不说说以全蛋白为内参的分析方法。

期刊JBC（The Journal of Biological Chemistry）在Western Blot数据要求中指出，对于半定量蛋白表达的实验，Z佳的内参为全蛋白内参，如果以看家蛋白为内参，需要提供其在实验处理中表达量恒定的实验证明。

全蛋白作为内参的优势在于:

1、目标蛋白的相对丰度为目标蛋白强度与全蛋白强度比，不再依赖于单一蛋白强度值。

2、敏感性好。

3、线性范围宽。

4、蛋白可视化。

5、更适用于低丰度表达蛋白。

如果考虑使用全蛋白作为内参，之前只有两种方法，一是使用考染胶，平行跑两块胶，问题在于很难保证重复性；二是使用丽春红染料进行印迹膜染色，问题在于稳定差，很难实现全蛋白定量，随着荧光蛋白染色技术的问世，全蛋白定量问题得以顺利解决。

AzureRed全蛋白染色进行归一化

“总蛋白归一化”或TPN变得越来越流行，可以避免依赖看家蛋白进行归一化的许多缺点。在该方法中，将目标蛋白的灰度值与加载在泳道中的总蛋白的灰度值进行比较。TPN比使用单一蛋白作为归一化更具有优势，例如不易受样品之间蛋白变化的影响，不是观察一种蛋白的强度，而是测量每条泳道的灰度值。由于TPN技术消除了许多与信号归一化相关的问题，因此发表文章越来越多地要求使用总蛋白信号进行归一化。

AzureRed荧光蛋白染色是一种用于凝胶和印迹膜的定量总蛋白染色试剂，与下游蛋白分析兼容，包括Western Blot。AzureRed是染色应用的理想选择，包括转印后染色以确认从凝胶到膜的蛋白质转移情况，以及定量蛋白。

AzureRed总蛋白和三个靶标蛋白同时成像

      向凝胶中加入稀释的HeLa细胞裂解物。转印后，将印迹用AzureRed染色，然后在不脱色情况下加入Tubulin，ß-actin和GAPDH探针。 用Sapphire 双模式多光谱激光成像系统扫描成像。四个通道进行叠加，总蛋白质（AzureRed染色）以灰色显示;Tubulin-红色，ß-actin-蓝色和GAPDH-绿色。

AzureRed荧光蛋白染色是荧光Western Blot定量的理想选择。宽广的线性动态范围确保AzureRed成为解决蛋白上样变化的有效标准。AzureRed的一个关键特性是将其融入现有Western Blot工作流程的简单性。

AzureRed染料可与常用荧光探针同时检测，无干扰，允许在一张印迹膜上检测多种蛋白质。使用AzureRed可以进行多色印迹的总蛋白归一化，不需要剥离和重孵育，可以在一张印迹膜上定量多种蛋白。 该方法快速，可以与感兴趣蛋白一同成像。有关AzureRed荧光蛋白染色的更多详细信息，请访问如下链接：www.azurebiosystems.com。

与常见的看家蛋白相比，AzureRed具有更宽的线性动态范围

单色通道图像A）AureRed染色总蛋白B）Tubulin C）β-action和D）GAPDH。AzureRed信号的优异动态范围与实际加载的蛋白量显示在图像（A）中。使用AzureSpot软件定量来自总蛋白和看家蛋白的信号，并将得到的值相对于每个样品加载的蛋白量（E）作图。与常见的看家蛋白相比，AzureRed表现出更强的相关性和更广泛的动态范围。

Sapphire配合AzureRed总蛋白荧光染色剂可以做总蛋白归一化和定量三个靶标蛋白，生成可以信赖的定量Western Blot数据。

Azure300带有Q模块，可激发AzureRed等染料进行全蛋白定量，Z后化学发光条带和总蛋白条带同时在一张膜上成像，满足Nature，JBC等期刊杂志的总蛋白定量要求，帮助用户发表文章。

专业的AzureSpot分析软件

可做AzureRed总蛋白的型号：

SapphireNIR-Q，SapphireRGB，SapphireRGBNIR；Azure300Q，Azure400，Azure500Q，Azure600

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