动植物DNA提取步骤是什么？

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  zky914 2013-09-24 00:00:00

  实验内容方法步骤 提取DNA（1）破碎细胞，释放DNA取5～10 mL鸡血细胞悬液注入50 mL烧杯中，加蒸馏水20 mL，同时，用玻璃棒沿一个方向快速充分搅拌，使血细胞过度吸水破裂，细胞核内物质释放出来，然后用纱布过滤取其滤液于500 mL烧杯中实验中应抓住关键并注意以下几点：(1)制备鸡血细胞液时，鸡血要在180 mL左右，并且在取新鲜鸡血的同时加入抗凝剂，使血液分层，取下层血细胞沉淀。(2)获取较多DNA的关键之一是向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，核内物质释放出来。(3)实验中共有3次过滤。过滤时使用的纱布层数与取其滤液或黏稠物有关。第1、3次要收集其滤液，使用的纱布为1～2层，第2次是要收集其滤出的黏稠物，使用的纱布为多层。 (4)实验中有6次搅拌，除Z后一次搅拌外，前5次搅拌均要朝向一个方向，并且在析出DNA、DNA再溶解和提取中，各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，以防止DNA分子断裂。(5)实验中有两次使用蒸馏水。一次在第1步，加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂，加水后必须充分搅拌，不应少于5 min，使血细胞充分破裂；第二次加蒸馏水是在第3步，加水是为了稀释NaCl溶液。(6)实验中有三次加NaCl溶液。在步骤2中，当加入NaCl后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在NaCl溶液中。在步骤5中，加NaCl溶液也是为了DNA的再溶解，不过这时溶液中蛋白质含量已很少。在步骤8中，加的NaCl溶液的浓度比前两次低得多，但还是为溶解DNA。(7)在步骤7中，沉淀DNA必须使用冷酒精(至少在5℃以下存放24 h)，并且将1份含DNA的NaCl溶液加入到2份的冷酒精中。如果悬浮在溶液中的DNA丝状物较少，可将混合液放入冰箱中再冷却几分钟。(8)盛放鸡血细胞液的容器和实验中的烧杯和试管Z好是塑料制的，因为玻璃制品表面带电荷，DNA中的磷酸基带相反的电荷，会被吸附于玻璃表面，减少DNA含量。(2)溶解核内的DNA：在滤液中加入2 mol／L的NaCl40 mL，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1 min，核中DNA游离并充分溶解，染色质中的DNA和蛋白质分离(3)析出含DNA黏稠物：沿烧杯内壁缓慢加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌。由于溶液浓度的下降，使得DNA溶解度下降，蛋白质溶解度上升，DNA析出成白色丝状黏稠物，当黏稠物不再增加时，停止加入蒸馏水。（这时溶液中NaCl的物质的量浓度相当于0.14 mol／L）(4)滤取含DNA黏稠物：用多层纱布过滤，取纱布上DNA的黏稠物 提纯DNA(5)DNA黏稠物再溶解：取含DNA黏稠物于50 mL烧杯内，加入2 mol/L的NaCl溶液20 mL，用玻璃棒沿一个方向不停搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解(6)过滤含DNA的NaCl溶液：用两层纱布过滤DNA的NaCl溶液，取其滤液(7)提取含杂质较少的DNA：在滤液中加入冷却的95%无水乙醇，并用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，由于DNA不溶于酒精，会出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸去表面的水分 鉴定DNA(8)DNA的鉴定：两支试管中各加入0.015 mol/L的NaCl溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，搅拌使其充分溶解后，向两支试管中分别加入4 mL二苯胺试剂，混匀后沸水浴中加热5 min，待试管冷却后，比较两试管的颜色变化，将发现加入DNA的试管中溶液呈蓝色，从而鉴定DNA的存在 （1）破碎细胞，释放DNA取5～10 mL鸡血细胞悬液注入50 mL烧杯中，加蒸馏水20 mL，同时，用玻璃棒沿一个方向快速充分搅拌，使血细胞过度吸水破裂，细胞核内物质释放出来，然后用纱布过滤取其滤液于500 mL烧杯中(2)溶解核内的DNA：在滤液中加入2 mol／L的NaCl40 mL，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1 min，核中DNA游离并充分溶解，染色质中的DNA和蛋白质分离(3)析出含DNA黏稠物：沿烧杯内壁缓慢加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌。由于溶液浓度的下降，使得DNA溶解度下降，蛋白质溶解度上升，DNA析出成白色丝状黏稠物，当黏稠物不再增加时，停止加入蒸馏水。（这时溶液中NaCl的物质的量浓度相当于0.14 mol／L）(4)滤取含DNA黏稠物：用多层纱布过滤，取纱布上DNA的黏稠物(5)DNA黏稠物再溶解：取含DNA黏稠物于50 mL烧杯内，加入2 mol/L的NaCl溶液20 mL，用玻璃棒沿一个方向不停搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解(6)过滤含DNA的NaCl溶液：用两层纱布过滤DNA的NaCl溶液，取其滤液(7)提取含杂质较少的DNA：在滤液中加入冷却的95%无水乙醇，并用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，由于DNA不溶于酒精，会出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸去表面的水分 实验中应抓住关键并注意以下几点：(1)制备鸡血细胞液时，鸡血要在180 mL左右，并且在取新鲜鸡血的同时加入抗凝剂，使血液分层，取下层血细胞沉淀。(2)获取较多DNA的关键之一是向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，核内物质释放出来。(3)实验中共有3次过滤。过滤时使用的纱布层数与取其滤液或黏稠物有关。第1、3次要收集其滤液，使用的纱布为1～2层，第2次是要收集其滤出的黏稠物，使用的纱布为多层。 (4)实验中有6次搅拌，除Z后一次搅拌外，前5次搅拌均要朝向一个方向，并且在析出DNA、DNA再溶解和提取中，各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，以防止DNA分子断裂。(5)实验中有两次使用蒸馏水。一次在第1步，加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂，加水后必须充分搅拌，不应少于5 min，使血细胞充分破裂；第二次加蒸馏水是在第3步，加水是为了稀释NaCl溶液。(6)实验中有三次加NaCl溶液。在步骤2中，当加入NaCl后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在NaCl溶液中。在步骤5中，加NaCl溶液也是为了DNA的再溶解，不过这时溶液中蛋白质含量已很少。在步骤8中，加的NaCl溶液的浓度比前两次低得多，但还是为溶解DNA。(7)在步骤7中，沉淀DNA必须使用冷酒精(至少在5℃以下存放24 h)，并且将1份含DNA的NaCl溶液加入到2份的冷酒精中。如果悬浮在溶液中的DNA丝状物较少，可将混合液放入冰箱中再冷却几分钟。(8)盛放鸡血细胞液的容器和实验中的烧杯和试管Z好是塑料制的，因为玻璃制品表面带电荷，DNA中的磷酸基带相反的电荷，会被吸附于玻璃表面，减少DNA含量。(8)DNA的鉴定：两支试管中各加入0.015 mol/L的NaCl溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，搅拌使其充分溶解后，向两支试管中分别加入4 mL二苯胺试剂，混匀后沸水浴中加热5 min，待试管冷却后，比较两试管的颜色变化，将发现加入DNA的试管中溶液呈蓝色，从而鉴定DNA的存在</SPAN></SPAN>

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