“进击的小蛋白”系列公开课丨用于GPCR冷冻电镜结构解析的蛋白融合策略

硫氧还蛋白（Thioredoxins）是一系列广泛存在于生物体内的氧化还原酶，它能通过置换硫代二硫化物来减少二硫键的结合。常用作融合表达标签的硫氧还蛋白A(TrxA), 分量为11.6kDa，来源于大肠杆菌。

TrxA标签最独特的优点是它的热稳定性。TrxA本身不作为亲和标签来进行重组蛋白优化，而是通过在高温条件下将杂蛋白变性去除而重组蛋白得以保存。TrxA也具有极好的促溶效率，用作促溶标签时可将重组蛋白的可溶性表达从12%提高至95%。

下面是针对trx标签常见问答解析：

①trx标签蛋白序列

MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA EWCGPCKMIA PILDEIADEY QGKLTVAKLN IDQNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL KEFLDANLAG SGSGHMHHHH HHSSGLVPRG

②带有trx标签会不会影响蛋白的抗原性

有可能的，trx标签是比较大的融合标签，有20多KDa，非常有可能改变蛋白的抗原决定簇。

一般为了不影响蛋白的功能，会在trx标签和目标蛋白之间加一个酶切位点，比如肠激酶的位点DDDDK，把trx标签去除掉。

③TRX标签蛋白怎么纯化

一般这个载体中都会有His 标签，直接用镍柱纯化即可

④常见的蛋白标签有哪些？有什么特点？

常见的蛋白标签有His-Tag、FLAG-Tag、HA-Tag、Myc-Tag、SUMO-Tag……

His-Tag

主要应用：蛋白纯化优选，也可用于检测。

特点：

• 分子量小，不影响目的蛋白的可溶性、结构和功能。

• 可在非离子型表面活性剂存在/变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时表现突出。

• 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和。

• 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

• 免疫原性相对较低。

FLAG-Tag

主要应用： 广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域，在真核表达系统中表达效率更高。

特点：

• 分子量小，不影响融合蛋白功能，比同类标签更具亲水性。

• 目的蛋白可直接通过FLAG标签进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白且纯化效率高。

• 可以被抗FLAG抗体所识别，便于通过WB、ELISA等方法对含有FLAG标签的融合蛋白进行检测、鉴定。

• 融合在目的蛋白N端的FLAG标签，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。

更多关于蛋白标签详情可以参看：https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag

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Thermo Scientific Tundra Cryo-TEM

新品发布

2020年11月18日，赛默飞世尔科技发布了全新的Thermo Scientific Tundra 冷冻透射电子显微镜(Cryo-TEM)。这是一种突破性的仪器，它以可承受的价格提供行业领先的易用性，将冷冻电子显微镜（Cryo -EM）扩展到更多的科学家。

赛默飞世尔科技生命科学部副总裁兼总经理Trisha Rice 如是说：

“ 冷冻电子显微镜可加速对于疾病的理解和ZL。但是，由于成本高昂，并且对于新用户而言复杂难以操作，因此很多研究院所都认为冷冻电镜遥不可及。我们与冷冻电子显微镜领域的权威专家合作开发的这一款仪器不仅可以提供用户所需的结果，更重要的是，能让更多的用户用上冷冻电子显微镜。”

Thermo Scientific Tundra Cryo-TEM

Tundra极大地简化了冷冻电子显微镜的使用，让任何经验水平的研究员都能轻松操作， 可提供：

人工智能和引导自动化

可帮助使用者快速鉴定样品质量，并轻松完成原本复杂的工作流程。使用过程中，结果以“红绿灯”的方式显示，便于使用者快速确定样品是否可用。

集成智能加样器

能够快速、轻松和稳健地装载样品，并转移到显微镜上进行即时评估和结构测定。

分辨率高达3.5埃

通过24～72小时数据采集，可实现标准样品3.5埃高分辨率的结构解析。

设计紧凑，占地面积小

可放在目前大多数标准尺寸的实验室中，无需进行实验室的改造。

赛默飞世尔科技将继续推动冷冻电子显微镜领域的创新，助力科学发现，加速对于疾病的理解和ZL。Tundra丰富了Thermo Scientific冷冻电子显微镜产品系列，是所有经验水平的用户都可以使用的一款普及型仪器。它是对中程冷冻电子显微镜单颗粒分析(SPA) 的多功能解决方案Thermo Scientific Glacios 冷冻电子显微镜以及性能和效率强大的Thermo Scientific Krios冷冻电子显微镜的有力补充。这三台冷冻电子显微镜可独立或联合使用，研究人员可根据自己的研究需要选择最合适的仪器。

想了解更多新品信息以及样品演示？

赛默飞将于2020全国电镜年会召开期间，线上线下同步举办Thermo Scientific Tundra Cryo-TEM新品发布会及冷冻电镜技术演示。现诚邀您莅临活动现场或者我们的直播间全程体验我们的领先科技，与我们的专家面对面探讨冷冻电镜前沿技术。莅临现场更有机会获得300kV冷冻透射电镜Krios G4积木一套！

赛默飞冷冻电镜专场活动日程安排

地点

成都新希望皇冠假日酒店

B1池畔吧/1F 香樟厅

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在生命科学领域中，包涵体复体的研究占据了重要的地位。但随着研究的深入，一些问题逐渐浮现。本文将对包涵体复体研究中常见的挑战进行解析，以及为研究者提供一些解决思路。

①包涵体复性原则：

低浓度，平缓梯度，低温。

②怎样洗涤包涵体？

通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。

③对于尿素和盐酸胍该怎么选择

尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。

盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。

④8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?

在4度放置半个月，都没什么问题 。在室温放置超过48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些处理BI溶液比较好。

⑤复性时的蛋白浓度

一般使用浓度为0.1-1.0mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。

⑥蛋白复性后浓度低

蛋白可能是在复性的过程中发生降解了。

可以将复性好的蛋白浓缩一下泡胶看看。复性过程一般都是低浓度蛋白，需要保证分子间有足够的折叠空间。一些未正确折叠的蛋白就存在于沉淀中，可能沉淀看不出来，复性后的蛋白高速离心看看。

⑦复性中蛋白析出是怎么回事？该怎么处理？

出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。

复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。

若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；

另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油。

⑧复性效果的检测

根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。

凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。

色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。

生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。

黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。

免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

⑨变性的融合蛋白可以制备多抗或者单抗吗？

变性蛋白只是天然蛋白伸直的产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

⑩纯化后的可溶性融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？

免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大，可以不用考虑。

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